Патология слизистых оболочек у женщин: роль микробиоты

В Киеве в октябре 2016 г. проходила научно-­практическая конференция с международным участием «Патология слизистых оболочек у женщин: роль микробиоты». Организаторами мероприятия являлись МЗ Украины, кафедра акушерства и гинекологии № 2 Национального медицинского университета имени А. А. Богомольца, благотворительный фонд развития инноваций медицины «РИМОН». Перед участниками конференции с докладами о влиянии микробиома на здоровье женщины выступили ведущие специалисты в области акушерства, гинекологии и микробиологии.

Доклад «Полимикробные урогенитальные биопленки» вниманию слушателей представил основатель и директор молекулярно-генетической лаборатории полимикробных инфекций и бактериальных биопленок клиники Шарите (Берлин, Германия), профессор А. Свидзинский (Alexander Swidsinski).

Несмотря на то что история изучения инфекционных заболеваний насчитывает уже несколько веков (со времени открытия в 1683 г. микроорганизмов Э. Левенгуком), природа полимикробных инфекций до сих пор не изучена. В 1864 г. Р. Кох сформулировал знаменитые постулаты, определяющие признаки микроорганизма как возбудителя заболевания:

• патоген имеется в организме больных людей и отсутствует у здоровых;
• возбудителя болезни необходимо изолировать от больного, и его штамм должен быть выращен в чистой культуре;
• при заражении чистой культурой микроорганизма здоровый человек заболевает.

Эти критерии являются основополагающими в отношении заболеваний, вызванных одной бактерией, однако существует огромное количество полимикробных инфекций. По мнению профессора А. Свидзинского, чтобы понять природу инфекционного процесса, недостаточно знать о наличии бактерий, необходимо проследить, что именно и в каком локусе они делают.

При микроскопии мазков влагалищного отделяемого Додерлейн в 1895 г. обнаружил большое количество грамположительных палочек, которые в дальнейшем были идентифицированы как лактобациллы. Ровно через 60 лет Г. Гарднер, изучая микрофлору влагалища женщин с диагнозом «неспецифический вагинит», отметил наличие клеток, поверхность которых обсеменена грам­отрицательными бактериями. Ученый назвал эти клетки ключевыми, а бактерии впоследствии получили название «гарднереллы» (Gardnerella vaginalis). Некоторое время спустя микробиологами было установлено, что эти микроорганизмы периодически обнаруживаются приблизительно у 40 % клинически здоровых женщин, т.е. по критериям Коха они не могут быть инфекционным агентом. В ходе дальнейших исследований было зафиксировано, что при бактериальном вагинозе (БВ) в вагинальных мазках выделяются не только гарднереллы.

Исследование биоптата слизистой влагалища у здоровых женщин продемонстрировало отсутствие какой-либо флоры на всей поверхности. При БВ гарднерелла «ведет себя корпоративно» и образует на поверхности биопленки, которые дают возможность расти другим бактериям (80 % Atopobium vaginae). При исследовании биопсийного материала можно обнаружить много групп микроорганизмов, которых нет у здоровых людей, но и не имеющих отношения к заболеванию. С образованием биопленок количество бактерий увеличивается максимально.

Использование специфических методов диагностики демонстрирует, что число лактобацилл на фоне БВ не уменьшается и даже, наоборот, увеличивается. Однако в мазке они не видны, так как происходят значительные изменения их морфологии: лактобациллы становятся маленькими и неравномерно окрашиваются. При изучении биопленок методом иммунофлуоресценции лактобактерии обнаруживаются на поверхности слизистой в большом количестве.

В окрашенных по Граму биоптатах видно, что биопленка растет вместе с клетками. Высокоинтенсивное слущивание и выход эпителиоцитов из влагалища происходят обязательно с выделением частиц биопленки. Это является чрезвычайно значимым для разработки неинвазивной диагностики БВ. Высокоэффективный и простой метод диагностики этого заболевания состоит в микроскопии окрашенных клеток отторгнутого эпителия, полученных из осадка мочи пациенток. На поверхности этих клеток фиксированы фрагменты биопленки, сформировавшиеся на слизистой влагалища.

Докладчик обратил внимание на то, что изменения осадка мочи, характерные для БВ, можно наблюдать не только у женщин репродуктивного возраста. Впервые ключевые клетки в анализах мужчин были обнаружены случайно. Заинтересовавшись вопросом о «мужском БВ», автор провел микробиологическое исследование проб мочи, взятых методом случайной выборки у 100 женщин, у 100 мужчин и у 100 детей в возрасте до 7 лет. В отобранных образцах гарднереллы обнаруживались в двух формах: дисперсной (единичные) и cohesive (сцепленной, или адгезивной, в составе биопленок). В большинстве случаев микроорганизмы не были выявлены. Дисперсные гарднереллы были выделены у части женщин и у некоторых детей. Биопленки обнаружили у 13 % женщин и у 7 % мужчин. У детей адгезивные гарднереллы отсутствовали.

Учитывая результаты собственных исследований, А. Свидзинский считает, что БВ является классическим инфекционным заболеванием. В возглавляемой им лаборатории при исследовании мочи 72 семейных пар, обследующихся в период беременности, 17 % женщин оказались носительницами биопленки, типичной для БВ. При этом у партнеров этих пациенток в 11 % проб также обнаружили биопленки в моче. Эти результаты убедительно доказывают, что перенос биопленки, а, следовательно, и заражение БВ возможно только при сексуальном контакте. Более низкая частота выявления гарднереллеза у мужчин может быть обусловлена анатомическими особенностями: микроорганизм размножается в препуциальном мешке, содержимое которого, как правило, не попадает в пробу мочи.

Ученый привел пример из личной практики, свидетельствующий об опасности инфицирования G. vaginalis при попытках фертилизации донорской спермой. При исследовании 20 произвольно отобранных образцов из банка спермы в четырех были обнаружены ключевые клетки, которые являются одним из диагностических критериев БВ. Безусловно, при подготовке этот биоматериал по возможности освобождают от эпителиальных клеток и лейкоцитов, однако при большом количестве слущенных клеток (что объясняется механическим воздействием при получении спермы донором) полная очистка невозможна.

Главная проблема, волнующая каждого практического врача, – это способы борьбы с заболеванием. Поскольку метронидазол входит во все рекомендованные схемы и считается оптимальным препаратом для лечения БВ, прежде всего исследовалось его влияние на рост биопленок. Согласно полученным результатам, в большинстве случаев биопленка не элиминировалась, в ней снизилась скорость обмена, т.е. входящие в ее состав бактерии переходили в фазу анабио­за. Спустя 6 нед по завершении курса терапии происходило полное восстановление активности биопленки. На основании этих наблюдений был сделан вывод, что применением метронидазола можно добиться только подавления роста бактерий, что обеспечивает не излечение БВ, а только временное ослабление симптомов.

Аналогичные результаты были получены и при исследовании эффективности в отношении биопленок антибиотика авелокс (моксифлоксацин). Лекарственное угнетение роста бактерий было значительно более глубоким, чем при использовании метронидазола, выздоровление отмечено у 50 % женщин. Однако полного разрушения биопленки не произошло, и через 12 нед она реактивировалась.

В дальнейшем в качестве средства локального интенсивного воздействия на биопленку был выбран антисептик октенисепт в форме раствора для орошения слизистой влагалища. Последовательно изменяя продолжительность курса терапии и кратность применения, удалось излечить более 60 % пациенток с рецидивирующим БВ. При этом во многих случаях выздоровление наступало у женщин с упорным течением заболевания и неэффективностью антибактериальной терапии.

В то же время неэффективность терапии почти у 40 % пациенток стимулировала ученых к поиску источника рецидивов. Результаты микробиологического исследования биоптатов слизистой сигмовидной кишки (n = 500) и полосок, наклеенных над перианальной областью, оказались отрицательными. Однако G. vaginalis была обнаружена в материале кюретажа из полости матки.

Интересные результаты были получены при сопоставлении распространенности БВ, лабораторно подтвержденного при изучении осадка мочи у пациенток больниц общего профиля и эндометрия, полученного при кюретаже полости матки по разным клиническим поводам. У 13 % госпитализированных женщин в образцах мочи выделена «корпоративная» G. vaginalis. У небеременных пациенток гарднереллезная биопленка была обнаружена в 19 % случаев, а у женщин после кюретажа по поводу выкидыша – в 43 %. Эти результаты подтверждают выводы о том, что БВ может быть причиной преждевременного прерывания беременности.

С целью подтверждения этого вывода было проведено исследование плаценты. Во всех образцах ткани плаценты > 12 нед гарднерелла не была обнаружена. Положительные результаты получены только при прерывании беременности на сроках от 7 до 13 нед. По мнению профессора А. Свидзинского, поражение матки БВ несовместимо с сохранением беременности.

Далее докладчик остановился на объяснении своей точки зрения относительно природы кандидоза и цистита. Изучение полимикробных сообществ традиционными культуральными методами невозможно. В то же время образование биопленки на полоске мембраны, вложенной на ночь во влагалище, доказывает, что и мультибактериальные общности можно выращивать и исследовать в культуре.

Грибы рода Candida не образуют биопленок. Они растут внутриэпителиально, а видимые при исследовании изменения представляют собой экссудат, отторгнутые эпителиальные клетки вместе с лейкоцитами. Биопленки всегда носят адгезивный характер, чего не наблюдается при кандидозе. Отличительной особенностью этого заболевания является его развитие совместно с другим бактериальным процессом.

В исследовании эффективности интравагинального применения молочной кислоты в лечении БВ, проводимом профессором А. Свидзинским, у женщин с сопутствующим диагнозом «цистит медового месяца» в анализах мочи были обнаружены измененные Escherichia cоli. На основании полученных результатов ученый пришел к выводу, что бактерии в моче появляются из влагалища, а не из мочевого пузыря.

Таким образом, ключом к пониманию полимикробных инфекций является многовидовая общность микроорганизмов, схожая с высокоразвитыми многоклеточными организмами. Для жизнедеятельности бактериальных сообществ неприменимы законы Коха.

В заключение докладчик акцентировал внимание на необходимости расширения взглядов клиницистов на бактериальные процессы. Современным врачам следует изменить привычную парадигму «одна бактерия – одна инфекция».

Л. М. Скивка, д.б.н., заведующая кафедрой микробиологии и общей иммунологии Учебно-научного центра «Институт биологии» Киевского национального университета имени Т. Г. Шевченко выступила с докладом «Микробиота мочеполового тракта мужчины и ее связь с фертильностью».

Докладчик представила результаты международного проекта «Микробиом человека» (Human Microbiome Project, 2008-2012), в ходе которого исследована микробиота (группировка симбиотических микроорганизмов, которые колонизируют отдельные участки организма человека) пяти компартментов, традиционно считавшихся нестерильными – ротовой полости, кожи, влагалища, кишечника, носоглотки (легких). Учеными было установлено, что более 70 % представителей симбиотической микробиоты организма человека – это некультурабельные микроорганизмы. Также был выявлен уникальный тип симбиоза сегментированных нитчатых бактерий с эпителиоцитами кишечника. Идентифицированы основные механизмы взаимосвязи нарушений симбиотической микробиоты и развития патологических состояний воспалительной этиологии. Причем это касалось не только тех компартментов, которые были колонизированы нарушенной группировкой микроорганизмов, но и отдаленных тканей и органов. Так, была исследована взаимосвязь между дисбиозом кишечника и возникновением нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Паркинсона.

В рамках вышеуказанного проекта было установлено, что не только влагалище колонизировано симбиотическими микроорганизмами, но и другие компартменты женского репродуктивного тракта, которые ранее считались стерильными, а именно шейка матки, матка, плацента, амниотическая жидкость, фетальные мембраны. При этом нарушения количественного и видового состава группировок таких микроорганизмов вызывают расстройства функционирования репродуктивной системы в целом.

Значительно более новым направлением научных исследований является изучение и выделение симбиотической микробиоты в репродуктивном тракте мужчины. За последние пять лет опубликовано небольшое количество работ, посвященных микробиому мужского полового тракта, при этом их результаты довольно противоречивы. Этому имеется три причины. Во-первых, на сегодняшний день обследована небольшая когорта мужчин (около 10 тыс.) как здоровых, так и с нарушенной фертильностью и воспалительными заболеваниями мочеполовой системы. Во-вторых, для исследователей определенную сложность представляет забор биологического материала для изучения микробиоты мужских половых путей (у женщин в частности может исследоваться абортивный материал). Третья причина заключается в отсутствии стандартизации забора биологического материала для анализа, а также стандартизации самих методов исследования симбиотических микроорганизмов.

Микробиота полового тракта мужчины исследуется с помощью как традиционных культуральных методов в сочетании с полимеразной цепной реакцией, так и более новых молекулярно-биологических, например секвенирования, в т.ч. нового поколения (определение последовательности нуклеотидов с последующим анализом первичной структуры ДНК и РНК). Эти методы имеют преимущества перед культуральным исследованием, поскольку последнее предоставляет ограниченную информацию ввиду того, что > 70 % симбиотических микроорганизмов являются некультурабельными. Кроме того, при применении молекулярно-биологических методов отсутствует потребность сохранять эти микроорганизмы живыми.

Примером использования молекулярно-биологических методов для идентификации микробных группировок и установления их взаимосвязи с репродуктивным здоровьем является анализ генов, кодирующих 16S рибосомную РНК (рРНК) микроорганизмов. Рибосомы представляют собой нуклеопротеины, в состав которых входит комплекс белков и РНК в соотношении 35-40:60-65 для микроорганизмов. 16S рРНК локализована в малой субъединице рибосомы. Гены 16S рРНК присутствуют в геноме всех бактерий и археев и отсутствуют в геноме эукариот и вирусов. Известно, что гены, кодирующие 16S рРНК, содержат как консервативные (одинаковые у всех прокариот), так и вариабельные или видоспецифические (характерные только для бактерий определенных видов) участки.

По данным Franasiak et al. (2015), патологические изменения количественных и видовых показателей симбиотической микробиоты оказывают существенное влияние на репродуктивную функцию человека на всех этапах ее реализации, включая:

• астено-, олиго-, лейкоспермию;
• нарушение фолликулогенеза и ответа на гонадотропины;
• нарушение оплодотворения и переноса эмбриона;
• изменение иммунного окружения, патологию имплантации, выкидыши;
• повышение риска потери беременности;
• преждевременные роды, задержку роста плода;
• послеродовые инфекции.

На сегодняшний день исследована и описана симбиотическая микробиота трех участков полового тракта мужчины: коронарной борозды, уретры и спермы. Установлено, что коронарная борозда и уретра колонизированы разнящимися по видовому составу симбиотическими микроорганизмами. Микробиота коронарной борозды имеет более стабильный состав (более низкий показатель α-разнообразия), нежели микробные группировки уретры. Состав микроорганизмов коронарной борозды пополняется за счет половых контактов и поэтому различается у лиц, находящихся в половых отношениях, и не имеющих таковых.

В видовом составе симбиотической микробиоты коронарной борозды преобладают (21,29 %) коринебактерии, которые характеризуются амфибиозом, т.е. способностью при определенных условиях вызывать инфекционные процессы. Учеными установлено, что вирулентность Corynebacterium spp. в составе симбиотической микробиоты зависит от их способности к образованию биопленок. Далее в количественном выражении следуют бактерии Staphylococcus spp. (19,15 %) и Anaerococcus spp. (18,48 %). К остальным составляющим симбиотической микробиоты коронарной борозды относятся представители рода Peptoniphilus (5,29 %), Prevotella (4,54 %), Finegoldia (3,25 %), Porphyromonas (2,48 %), Propionibacterium (2,25 %), Delftia (1,51 %), другие классифицированные (11,20 %) и неклассифицированные (10,57 %) микроорганизмы (Nelson et al., 2012). Изменение видового состава микробиоты, в частности в сторону превалирования анаэрококков, может привести к развитию инфекционных заболеваний мочеполового тракта мужчины.

На состав микробиоты коронарной борозды существенно влияет обрезание крайней плоти, снижая риск ВИЧ-инфицирования. Механизм протективной роли обрезания заключается в способности микроорганизмов определять или программировать состав клеток иммунной системы в слизистых оболочках, в т.ч. полового тракта. Обрезание крайней плоти способствует снижению содержания анаэробных микроорганизмов в составе этой микробной группировки при увеличении количества микроорганизмов, характерных для микробиоты кожи, таких как стафилококки. Эти видовые изменения микробиоты коронарной борозды вызывают уменьшение относительного количества в составе представительства иммунной системы в этом компартменте CD4+ Т-лимфоцитов, которые являются основными мишенями ВИЧ. Таким образом обрезание может минимизировать риск инфицирования этим вирусом.

Взаимосвязь между составом микробиоты коронарной борозды/уретры и развитием бесплодия пока сложно охарактеризовать ввиду того, что исследования еще продолжаются. По мнению специалистов, наибольшее влияние на фертильность мужчин оказывает состав микробной группировки спермы. До недавнего времени считалось, что бактериоспермия является признаком патологических состояний репродуктивного тракта, обязательно сочетается с лейкоспермией и достоверно указывает на наличие бесплодия у такого пациента. Однако исследователи опровергли это утверждение, заявив, что сперма здоровых фертильных мужчин содержит симбиотические микроорганизмы. Вместе с тем у бесплодных мужчин количество КОЕ/мг микроорганизмов в сперме составляет 10⁵ против 10³ у здоровых лиц. У бесплодных пациентов спермальная микробиота характеризуется значительно большим видовым (α) разнообразием.

Распределение нормальной спермальной микробиоты по таксонам выглядит следующим образом: Lactobacillus – 19 %, Pseudomonas – 10 %, Prevotella – 8 %, Gardnerella – 5 %, Rhodanobacter, Streptococcus, Finegoldia, Haemophilus – по 3 %, Staphylococcus, Corynebacterium, Clostridium, Stenotrophomonas, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia – по 2 %, Campylobacter – 1 %, другие – 32 % (Weng et al., 2014).

Weng et al. (2014) выделяют три типа микробных группировок в сперме в зависимости от того, какой вид микроорганизмов превалирует:

• G1-тип (преобладают псевдомонады) идентифицирован приблизительно у 90 % бесплодных мужчин и у небольшого количества здоровых;
• G2-тип (лактобациллы) – у 95 % здоровых фертильных мужчин;
• G3-тип (превотеллы) – у 99 % бесплодных мужчин.

Известно, что у бесплодных мужчин в видовом составе микробиоты спермы значительно уменьшено относительное количество лактобацилл, несколько снижено содержание гарднерелл, а также увеличено число бактерий рода Prevotella и вдвое больше представителей рода Haemophilus.

Вышеуказанные авторы разработали алгоритм определения типа микробной группировки спермы. Согласно этому алгоритму, если при расчете соотношение Lactobacillus/(Prevotella + Pseudomonas + Haemophilus) > 0,57, речь идет о G2-типе микробной группировки в сперме; если этот показатель < 0,57, следует рассчитать соотношение Prevotella/Pseudomonas: если оно > 1,37, такую группировку относят к G3-типу, если < 1,37 – к G1-типу.

Одним из источников спермальной микробиоты предположительно могут быть семенные пузырьки, в которых продуцируется 50-70 % спермальной плазмы. Секрет везикулярных желез богат фруктозой, которая является основным источником метаболической энергии для сперматозоидов и одновременно может быть источником питания для фруктозофильных микроорганизмов, к которым относят лактобациллы.

Симбиотические микроорганизмы в репродуктивном тракте мужчины выполняют ряд функций, в частности:

• синтезируют нейромедиаторы, которые обеспечивают взаимодействие колонизированного компартмента с нервной системой;
• обеспечивают конкурентную и колонизационную резистентность;
• поддерживают целостность эпителиального (в т.ч. гематотестикулярного) барьера;
• синтезируют антимикробные соединения;
• стимулируют продуцирование антимикробных соединений эпителиоцитами;
• разрушают канцерогены;
• формируют популяционный состав и функциональную поляризацию резидентных клеток иммунной системы в колонизированном компартменте.

Нарушение видового и количественного состава симбиотической микробиоты в репродуктивном тракте мужчины может вызывать уменьшение количества регуляторных Т-клеток в локальном представительстве иммунной системы в этом компартменте, а также провоспалительную поляризацию резидентных дендритных клеток и макрофагов. Следствием этого является провоспалительная (повреждающая) реакция дендритных клеток и макрофагов относительно развивающихся сперматозоидов, что приводит к уменьшению их жизнеспособности и снижению качества спермы.

Л. М. Скивка отметила, что нельзя рассматривать микробиоты полового тракта мужчины и женщины изолированно. Симбиотическая микробиота мужского полового тракта, несомненно, влияет на репродуктивное здоровье женщины. Незащищенные половые контакты способствуют обмену представителями симбиотической микробиоты между партнерами. Оппортунистические патогены в составе микробиоты полового тракта мужчины характеризуются амфибиозом, который в условиях ослабления микробного гомеостаза влагалища может стать причиной БВ. Защелачивание среды влагалища, происходящее во время незащищенных половых контактов, может вызывать сдвиг видового состава микробиоты в сторону уменьшения относительного количества лактобацилл и повышать риск развития БВ. Негативное влияние микробиоты мужского полового тракта на репродуктивное здоровье женщины многократно усиливается в условиях частой смены половых партнеров.

Вместе с тем незащищенные половые контакты с постоянным партнером способствуют формированию партнерспецифической толерантности иммунной системы репродуктивного тракта женщины к спермальным антигенам, крайне необходимой для оплодотворения и нормального течения гестации. Одним из факторов формирования партнерспецифической толерантности могут быть антигены симбиотических микроорганизмов.

Подготовили Виктория Лисица и Марина Малей