Вплив силімарину на здатність до запліднення

Силімарин – стандартизований екстракт (суміш трьох ізомерів флаволігнанів) із висушених плодів розторопші плямистої. Він має антиоксидантний ефект (підвищення рівня глутатіону, активація супероксиддисмутази та глутатіонпероксидази), внаслідок чого відбувається очищення клітин від вільних радикалів. Крім того, силімарин гальмує утворення шкідливих для клітини хімічних речовин [6, 7]. У численних випробуваннях на експериментальних моделях було доведено, що він є мембранним стабілізатором, який запобігає ліпопероксидації та пов’язаному з нею клітинному ураженню [8].
У дослідженні Plіskova et. al. (2005) було виявлено, що силімарин та його компоненти викликають часткову або повну активацію естрогенних рецепторів. Так, силібін В, один із компонентів силімарину, має слабку опосередковану естрогенними рецепторами активність; силібін А та інші флаволігнани не є активними; таксифолін (дигідрокверцетин) – потужний агоніст естрогенних рецепторів [9]. З огляду на антиоксидантний ефект препарату та його здатність до активації естрогенних рецепторів можна припустити, що силімарин і його компоненти впливають на фолікулогенез, дозрівання ооцитів, апоптоз гранульозних клітин, потовщення ендометрія.
Нормальне дозрівання та ріст ооцитів залежать від адекватного функціонування гранульозних клітин оваріальних фолікулів [1]. При цьому апоптоз клітин гранульози ймовірно негативно впливає на розвиток фолікулів, якість ооцитів та показник настання вагітності [2]. Активні форми кисню (АФК) відіграють роль основних сигнальних молекул як фізіологічних, так і патологічних процесів жіночої репродуктивної системи. АФК беруть участь у регуляції всього спектра фізіологічних репродуктивних функцій – фолікулогенезу, дозрівання ооцитів, стероїдогенезу, функціонування жовтого тіла, лютеолізу [3].
Відомо, що фолікулярна рідина формує мікрооточення для ооциту і є джерелом речовин, необхідних для його розвитку. Крім того, вона забезпечує потужний антиоксидантний ферментативний захист ооцитів від окислювального стресу [3, 4]. Зміни в антиоксидантній ферментативній системі можуть призводити до зниження ефективності очищення фолікула від АФК і виникнення окислювального стресу. Було доведено, що підвищення концентрації АФК у фолікулярній рідині пов’язане з посиленням апоптозу гранульозних клітин і порушенням розвитку фолікулів [5].
У даному інтервенційному дослідженні вивчали вплив силімарину на фолікулогенез і апоптоз клітин гранульози. Це була перша спроба оцінити доцільність призначення цього препарату з метою підвищення ймовірності настання вагітності у пацієнток, яким проводилося лікування методом екстракорпорального запліднення (Іn Vitro Fertilization, IVF).

Методи та хід дослідження

У Центрі репродуктивної медицини монастирської лікарні при Університеті медичних наук (Мешхед, Ісламська Республіка Іран) з квітня 2006 по квітень 2007 р. проводилося дослідження за участю 40 жінок віком 18-35 років. У зв’язку з наявністю у парі чоловічого фактора безпліддя всі вони проходили лікування методом IVF.
Критеріями включення у випробування слугували: безпліддя, зумовлене виключно чоловічим фактором (загальна кількість рухливих сперматозоїдів менше 5 млн у зразку); проходження жінками циклів інтрацитоплазматичних ін’єкцій сперматозоїдів; вік досліджуваних – 18-35 років. Критеріями виключення були паління, попереднє вживання вітамінів С, Е та інших антиоксидантів і продовження терапії ними.
У протоколах були зафіксовані демографічні дані всіх пацієнток, висновки їхнього фізикального обстеження, рівень гормонів, стан маткових труб і наявність супутніх захворювань.
Перед початком виконання циклів методом рандомізованого відбору пацієнтки були розподілені на дві групи по 20 в кожній. Усі вони проходили стандартний довгий протокол циклу IVF. Після пригнічення впливу гіпофіза внаслідок прийому аналога гонадотропного рилізинг-фактора і від першого дня оваріальної стимуляції перша група учасниць отримувала гонадотропін і силімарин (70 мг 3 рази на день), а друга (контрольна) – гонадотропін і плацебо.
Трансвагінальне УЗД проводили для оцінки розвитку фолікулів та потовщення ендометрія на 6-й день після призначення людського менопаузального гонадотропіну, а згодом – через день, залежно від розмірів фолікулів. Коли щонайменше три фолікули досягали розміру ≥ 18 мм, призначали людський хоріонічний гонадотропін (лХГ) дозою 10 000 МО внутрішньом’язово. Через 34-36 год після ін’єкції лХГ під трансвагінальним ультрасонографічним контролем здійснювали аспірацію ооцитів. Якість ооцитів досліджувалась ембріологом відповідно до комплексної системи класифікації, включаючи оцінку статусу дозрівання ооцитів, їхньої морфологічної якості, здатності до запліднення від І до ІV сту-пеня [10].
Вимірювання рівня апоптозу клітин гранульози проводили методом рідинної цитометрії. Апоптотичні гранульозні клітини виявляли за допомогою анексину V і йодиду пропідію. У 10 рандомізовано відібраних жінок гранульозні клітини були ізольовані від кожного аспірованого фолікула при використанні гіалуронідази. Аналіз експозиції фосфатидилсерину (ранньої ознаки апоптозу) в клітинах гранульози було проведено наступним чином. Спочатку гранульозні клітини промили кальцієвим буфером, при цьому концентрацію клітин доводили до показника 1,5 х 106 клітин/мл у кальцієвому буфері. Потім 10 мкл анексину V-FITC додали до 100 мкл клітинної суспензії та інкубували протягом 20 хв на льоду в темряві. Після інкубації клітини знову промили кальцієвим буфером, до суспензії додали 10 мкл йодиду пропідію та інкубували протягом щонайменше 10 хв на льоду. Таким чином, клітинна суспензія була готова для аналізу рідинним цитометром. Позитивний контроль здійснювали за допомогою інкубації з дексаметазоном.
У пацієнток обох груп були проаналізовані кількість фолікулів різних розмірів, товщина ендометрія в день ін’єкції лХГ, кількість і якість відновлених ооцитів, рівень раннього та загального апоптозу. Значення показника р < 0,05 вважалося статистично значимим.

Результати дослідження та їх обговорення

Усі 40 жінок пройшли дослідження до кінця. Середній вік пацієнток у першій групі становив 28,38 року (стандартне відхилення [СВ] 4,59), у другій – 27,59 (СВ 4,05), що свідчить про несуттєву вікову відмінність жінок в обох групах. Інші параклінічні параметри досліджуваних наведені в таблиці 1.

Середні показники кількості фолікулів розмірами ≥ 18 мм, 15-17 мм, а також загальної кількості відновлених ооцитів значимо не відрізнялися в жінок обох груп (р = 0,118, р = 0,36 і р = 0,125 відповідно). Також не виявлено суттєвої різниці за показником потовщення ендометрія (р = 0,673) (табл. 2).

Показники раннього і загального апоптозу у жінок першої групи були значимо нижчими в порівнянні з групою контролю (р = 0,014 і р = 0,027 відповідно), у той же час показник пізнього апоптозу виявився не набагато нижчим (р = 0,086) (табл. 3).

Вищевказані дані важливі з урахуванням наступного. Клітини гранульози необхідні для нормального дозрівання фолікулів, тому що саме вони синтезують стероїдні гормони та фактори росту, а також відіграють важливу роль у процесі атрезії фолікула. Апоптоз гранульозних клітин чинить негативний вплив на дозрівання фолікулів. Його високий рівень пов'язують із меншим числом відновлених ооцитів та нижчою якістю ооцитів і ембріонів [2].
Різні патологічні стимули, такі як окислювальний стрес, можуть ініціювати апоптоз ооцитів у ссавців [11]. Внутрішньоклітинне накопичення АФК, тобто окислювальний стрес, може ушкоджувати клітини, викликаючи розриви ланцюгів ДНК, перекисне окислення ліпідів, білкову деградацію, що призводять до загибелі клітин [12]. Існує припущення, що стероїдогенно активні клітини, наприклад клітини гранульози антральних фолікулів, витрачають багато енергії, генеруючи при цьому велику кількість АФК [13]. Тому цілком можливо, що окислювальний стрес впливає на запуск процесів апоптозу в здорових стероїдогенних антральних фолікулах [2].
Слід зазначити, що останнім часом з’являється все більше публікацій, в яких автори звертають увагу на негативний вплив окислювального стресу щодо реалізації репродуктивної функції жінки [2, 3]. Цей патологічний стан можна усунути за рахунок зниження утворення АФК або посилення загального антиоксидантного захисту.
Tsani et al. (2006) проводили оцінку протилежних ефектів ФСГ та виснаження запасів глутатіону на утворення АФК і виникнення апоптозу в культивованих преовуляторних фолікулах. Так, учені визначили, що окислювальний стрес індукує апоптоз в преовуляторних фолікулах. Антиапоптотичного впливу ФСГ було досягнуто за рахунок стимуляції синтезу фолікулярного глутатіону та зниження рівня АФК [14].
Kummer et al. (2001) зазначають, що утеротропні ефекти після 30-денного лікування силімарином проявилися у збільшенні висоти люмінального епітелію та ендометрія у щурів після оваріоектомії [15].

Висновок

У даному дослідженні було доведено, що при прийомі силімарину жінками, яким здійснювали інтрацитоплазматичні ін’єкції сперматозоїдів у зв’язку з наявністю у парі чоловічого фактора безпліддя, апоптоз клітин гранульози у них зменшився, а розвиток фолікулів незначно збільшився. Товщина ендометрія в день ін'єкції лХГ несуттєво відрізнялась у пацієнток в обох групах, що можна пояснити короткою тривалістю лікування.
Отже, отримані результати свідчать про те, що застосування силімарину у пацієнток, які проходять цикли IVF, сприяє зменшенню апоптозу гранульозних клітин і таким чином підвищує ймовірність настання вагітності.

Література
1. Sharpe-Timms K.L., Zimmer R.L. Oocyte and pre-embryo classification. In: Keel B.A., May J.V., De Jonge C.J., eds. Handbook of the assisted reproduction laboratory. London, CRC Press LLC, 2000: 179-96.
2. Jancar N. et al. Effect of аpoptosis and reactive oxygen species production in human granolusa cells on oocyte fertilization and blastocyst development. Journal of assisted reproduction and genetics, 2007, 24: 91-7.
3. Agarwal A., Gupta S., Sharma R.K. Role of oxidative stress in female reproduction. Reproductive biology and endocrinology, 2005, 14: 3-28.
4. Carbone M.C. et al. Antioxidant enzymatic defences in human follicular fluid: characterization and age-dependent changes. Molecular human reproduction, 2003, 9 (11): 639-43.
5. Valdez K.E., Cuneo S.P., Turzillo A.M. Regulation of apoptosis in the atresia of dominant bovine follicles of the first follicular wave following ovulation. Journal of reproduction, 2005, 130: 71-81.
6. Dermarderosian A. The review of natural products, 1st ed. St Louis, Facts and Comparisons Inc., 2001: 405-9.
7. Fleming T., ed. PDR for herbal medicines. Montvale, New Jersey, Medical Economics Co., 2005: 566-7.
8. Shalan M.G. et al. Amelioration of lead toxicity on rat liver with vitamin C and silymarin supplements. Toxicology, 2006, 206: 1-15.
9. Pliskova M. et al. Effects of silymarin flavonolignans and synthetic silybin derivatives on estrogen and aryl hydrocarbon receptor activation. Toxicology, 2005, 215 (1/2): 80-9.
10. Dale B., Di Matteo L., Wilding M. Mitochondria in reproduction. In: Elder K, Cohen J, eds. Human preimplantation embryo selection. London, Informa HealthCare, 2007: 276-9.
11. Roth Z., Hansen P.J. Involvement of apoptosis in disruption of developmental competence of bovine oocytes by heat shock during maturation. Biology of reproduction, 2004, 71 (6): 1898-906.
12. Yu B.P. Cellular defences against damage from reactive oxygen species. Physiological reviews, 1994, 74: 139-62.
13. Rapoport R., Shlan D., Hanukoglu I. Electron leakage from the adrenal cortex mitochondrial P450 scc and P450 cll systems: NADPH and steroid dependence. Archives of biochemistry and biophysics, 199, 5617: 412-6.
14. Tsai-Turton M., Luderer U. Opposing effects of glutathione depletion and follicle-simulating hormone on reactive oxygen species and apoptosis in cultured preovulatory rat follicles. Endocrinology, 2006, 147 (3): 1224-36.
15. Kummer V. et al. Estrogenic effects of silymarin in ovariectomized rats. Veterinarni-Medicina-UZPI (Czech Republic), 2001, 46: 1-23.