Чувствительность грибов рода Candida к препаратам азолового ряда

Развитие резистентности к противогрибковым препаратам является основной проблемой в лечении кандидоза. Поэтому для эффективной терапии определение чувствительности различных штаммов Candida spp. к применяемым антифунгальным препаратам имеет особое значение. Предлагаем вашему вниманию обзор статьи K. Zomorodian, A. Bandegani, H. Mirhendi et al., в которой представлены результаты исследования in vitro, проведенного авторами с целью определения чувствительности клинических изолятов Candida spp. к нескольким препаратам азолового ряда, а также частоты развития эффекта парадоксального роста.

Кандидоз представляет собой инфекционное заболевание, которое характеризуется широким спектром симптомов: от умеренного дерматоза до системного поражения с высоким уровнем смертности. Дрожжеподобные грибы рода Candida являются наиболее частым видом грибов, выделяемых у больных раком. Они занимают второе место в структуре причин катетер-ассоциированной инфекции мочевыводящих путей, третье – среди патогенов, вызывающих сепсис у детей и, наконец, четвертое – по частоте нозокомиальной гематогенной грибковой инфекции с высочайшим уровнем смертности. В последнее время наблюдается тенденция к увеличению доли кандидозов, вызванных грибами вида non-albicans. Несмотря на то что вид Candida аlbicans по-прежнему является наиболее распространенным, частота выявления non-аlbicans значительно повысилась. Кроме того, важнейшей проблемой является растущая резистентность дрожжеподобных грибов, особенно вида non-albicans, к современным антифунгальным препаратам. Появление устойчивых штаммов повышает частоту случаев неэффективного лечения, а также риск развития осложнений и смертности, обусловливает увеличение срока пребывания пациента в стационаре. Некоторые факторы, например деятельность человека, чрезмерное или неправильное применение антибиотиков, увеличение в популяции количества иммунокомпрометированных лиц, усугубляют эту проблему. Поэтому первым шагом в преодолении антифунгальной резистентности является определение уровней локальной устойчивости.

С этой целью Институтом клинических лабораторных стандартов США и Европейским комитетом по определению антимикробной чувствительности рекомендовано два метода: метод последовательных микроразведений в питательной среде и диско-диффузионный. В процессе определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) препаратов этими методами основными проблемами становятся прочтение и интерпретация результатов. Трудности в оценке МИК связаны с так называемым феноменом парадоксального роста. Сущность этого явления состоит в сохраняющемся (хотя и уменьшенном) росте дрожжеподобных грибов в серии последовательных микроразведений. Хотя первопричина этого эффекта остается невыясненной, многими исследователями выдвинуто предположение о роли активации некоторых генов, участвующих в формировании резистентности к азольным препаратам. Кроме того, некоторые авторы считают, что в формировании феномена могут принимать участие такие факторы, как размер инокулюма, температура инкубации и молекулярная характеристика штаммов. Ряд ученых обнаружили, что добавление к питательной среде RPMI глюкозы или коррекция среднего уровня рН ≤ 5 способствует подавлению эффекта парадоксального роста. Несмотря на то что феномен парадоксального роста может осложнить определение МИК, он не свидетельствует о клинической резистентности. В соответствии с результатами экспериментов на моделях мышей изоляты, проявляющие данный эффект in vitro, могут оказаться чувствительными in vivo.

Целью представленного в статье исследования было определение in vitro чувствительности клинических изолятов Candida spp. к нескольким препаратам азолового ряда, а также частоты развития эффекта парадоксального роста.

Материалы и методы исследования

Выделение и идентификация видов дрожжеподобных грибов

В общей сложности было протестировано 193 штамма грибов рода Candida, выделенных из клинического материала. Изоляты были получены из разных биотопов тела: 118 (57,6 %) – из ротовой полости; 64 (30,7 %) – из крови; 17 (8,3 %) – из генитального тракта; 7 (3,4 %) – из дыхательных путей. С целью первичной идентификации и выделения смешанных видов все изоляты дрожжеподобных грибов были посеяны на среду CHROMagar Candida. Идентификацию грибов проводили посредством метода полимеразной цепной реакции с анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов.

Определение антифунгальной чувствительности

Чувствительность к флуконазолу, кетоконазолу, вориконазолу и итраконазолу исследовалась методом микроразведений в бульоне. МИК определяли визуально через 24 и 48 ч. МИК считалась минимальная концентрация лекарственного средства, при которой наблюдается подавление видимого роста микроорганизма (уменьшение мутности бульона) в сравнении с таковым в контрольном образце, не содержащем медикамента. Каждый опыт проводили троекратно. Эффект парадоксального роста, характеризующийся неполным подавлением роста, фиксировали через 48 ч инкубации. Кроме того, 10 мкл питательной среды из ячеек, в которых не отмечено видимого роста грибов, в дальнейшем были высеяны на агар Сабуро с декстрозой для определения минимальной фунгицидной концентрации (МФК). МФК считалась наиболее низкая концентрация с содержанием ≤ 4 колоний, что соответствует элиминации 98 % грибов первоначального инокулюма.

Критерии оценки (пограничные значения) чувствительности исследуемых антифунгальных препаратов соответствовали предложенным Институтом клинических лабораторных стандартов США. Пограничные значения МИК для флуконазола ≤ 8 мкг/мл, 16-32 мкг/мл и 64 мкг/мл соответствовали характеристикам категорий: чувствительные, чувствительные в зависимости от дозы, резистентные. Для итраконазола эти показатели составили ≤ 0,12 мкг/мл; 0,25-0,5 мкг/мл и ≥ 1 мкг/мл соответственно. Для валидации результатов были использованы два контрольных штамма (C. albicans ATCC 10261 и C. krusei ATCC 6258).

Наличие эффекта парадоксального роста определялось в штаммах тех грибов, которые проявляли чувствительность к МИК через 24 ч инкубации и резистентность – в последующие 48 ч.

Результаты

Методом полимеразной цепной реакции с анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов идентифицированы следующие виды дрожжеподобных грибов: 114 (59,1 %) С. albicans; 27 (14,0 %) C. parapsilosis; 17 (8,8 %) C. tropicalis; 16 (8,3 %) C. glabrata; 14 (7,2 %) C. dubliniensis; 3 (1,6 %) C. krusei; 2 (1,0 %) C. guilliermondii. Результаты определения чувствительности всех видов грибов к флуконазолу, кетоконазолу, вориконазолу и итраконазолу представлены в таблице 1.

К флуконазолу оказались чувствительными 73 % изолятов (МИК ≤ 16,0 мкг/мл), чувствительными в зависимости от дозы – 6,2 % и резистентными – 20,8 %. Среди 40 резистентных штаммов 24 (60 %) принадлежали к виду С. albicans, 11 (27,5 %) – C. tropicalis и 3 (7,5 %) – C. dubliniensis. При сравнении этих видов грибов выявлено, что C. tropicalis имели самый высокий (64,7 %) уровень резистентности к флуконазолу.

К итраконазолу проявили чувствительность 59,1 % изолятов грибов, дозозависимую чувствительность – 12,4 % и резистентность – 28,5 %. Из 55 устойчивых штаммов 40 (72,7 %) идентифицированы как C. albicans, 11 (20 %) – C. tropicalis, 3 (5,5 %) – как C. dubliniensis и 1 (1,8 %) как C. parapsilosis. Среди всех протестированных видов самый высокий уровень резистентности выявлен у C. tropicalis (64,7 %). Все исследованные штаммы C. glabrata, C. guilliermondii и C. krusei оказались чувствительными к итраконазолу.

Чувствительность и устойчивость к вориконазолу обнаружены у 73,6 и 26,4 % изолятов Candida соответственно. Установлено, что наиболее высоким (47,1 %) уровнем резистентности обладают грибы вида C. tropicalis. Все выделенные штаммы C. glabrata, C. guilliermondii и C. krusei проявили чувствительность к вориконазолу.

Из общего количества исследованных изолятов только три оказались резистентными к кетоконазолу, в т.ч. два из вида C. albicans и один C. dubliniensis. Однако чувствительность в зависимости от дозы к кетоконазолу обнаружена у 24 видов дрожжеподобных грибов, из них – 21 C. albicans, 2 – C. tropicalis и 1 – C. dubliniensis.

Распределение частоты выявления феномена парадоксального роста протестированных штаммов грибов представлено в таблице 2. Наиболее высокий уровень парадоксального роста был индуцирован вориконазолом (14 %). Остальные препараты по данному показателю распределились следующим образом: итраконазол (13,5 %), флуконазол (12,4 %) и кетоконазол (9,8 %).

Обсуждение

Флуконазол является одним из наиболее широко назначаемых антифунгальных препаратов для лечения поверхностного и системного кандидоза. Уровень резистентности к данному препарату в разных странах варьируется от 2,9 до 85 %, что объясняется различиями в протоколах и стратегиях лечения (Lee J.S. et al., 2007; Panizo M.M. et al., 2009; Shokohi T. et al., 2011;). Согласно результатам представленного в этой статье исследования, приблизительно пятая часть протестированных видов Candida оказалась устойчивой к флуконазолу, что как минимум в два раза больше, чем сообщалось ранее. Можно предположить, что такая разница в показателях чувствительности к флуконазолу обусловлена широким применением этого препарата как для лечения, так и для профилактики. Среди всех протестированных видов дрожжеподобных грибов C. tropicalis оказались наиболее устойчивыми к флуконазолу, что совпадает с результатами исследования Seman et al. Несмотря на то что имеются сведения о природной резистентности к флуконазолу C. glabrata, в данном исследовании не было обнаружено устойчивых штаммов этого вида грибов.

Итраконазол имеет более широкий спектр противогрибковой активности, чем флуконазол и обычно назначается для лечения системной грибковой инфекции, в т.ч. кандидоза. В недавних исследованиях выявлено, что уровень резистентности к данному препарату варьируется от 2 до 38,4 %. Согласно данным настоящего исследования, наиболее высокий уровень резистентности грибов определялся в отношении итраконазола в сравнении с другими препаратами азолового ряда, что согласуется с результатами еще нескольких более ранних исследований (Lee J. S. et al., 2007; Panizo M. M. et al., 2009; Badiee P. et al., 2010). Наиболее устойчивыми к итраконазолу видами были С. albicans (72,7 %) и C. tropicalis (20 %).

Кетоконазол – это противогрибковое средство, производное имидазола, для местного применения. Уровни резистентности к кетоконазолу грибов рода Candida остаются низкими – от 1 до 37 %. В соответствии с результатами описанного в статье исследования только 1,5 % протестированных штаммов дрожжеподобных грибов оказались устойчивыми к кетоконазолу, что может быть обусловлено способом применения (местно) или низкой частотой назначения по сравнению с другими препаратами азолового ряда.

Установлено, что противогрибковые средства обладают свойством индуцировать эффект парадоксального роста. Согласно результатам данного исследования, наиболее высокая частота этого феномена отмечена у С. albicans и C. dubliniensis. Из 114 изолятов С. albicans у 14,9-21 % определялся парадоксальный рост в тестах с исследуемыми азолами. Следует отметить, что указанное явление не обнаружено в штаммах C. parapsilosis, C. krusei, C. guilliermondii и C. glabrata. Влияние эффекта парадоксального роста на резистентность микроорганизмов изучалось ранее (Arthington-Skaggs B. A. et al., 2002). Очевидной корреляции между его наличием и клиническим исходом заболевания не выявлено.

В данном исследовании были обнаружены высокие уровни резистентности дрожжеподобных грибов к итраконазолу и флуконазолу. Полученные результаты обусловливают необходимость проведения регулярного исследования чувствительности к антифунгальным препаратам в медицинских учреждениях. Мониторинг локальных уровней чувствительности также способствует разработке эффективных рекомендаций по профилактике, эмпирической терапии и ведению пациентов с кандидозом.

Подготовила Виктория Лисица

По материалам: K. Zomorodian, A. Bandegani, H. Mirhendi et al.

In Vitro Susceptibility and Trailing Growth Effect of Clinical Isolates of Candida Species to Azole Drugs // Jundishapur J Microbiol. 2016; 9 (2): e28666.