Бактеріофаги: нова-стара зброя в еру антибіотикорезистентності

С.А. Заіка

Антибіотикорезистентність є серйозним викликом у боротьбі та профілактиці хвороб, спричинених патогенними бактеріями. Безконтрольне використання антибіотиків і відсутність своєчасної регуляції їх застосування призвели до того, що все більше бактерій набувають стійкості до багатьох видів препаратів даної групи. Це нівелює ефективність антибіотикотерапії й у майбутньому може призвести до понад 5 млн смертей від бактеріальних хвороб та їх ускладнень у світі щороку й до 10 млн на рік – до 2050 року. Як і будь-які живі організми, бактерії перебувають під постійним тиском природного відбору й мають свої патогени, серед яких головну роль відіграють віруси – бактеріофаги. Вони є природними регуляторами ­чисельності бактерій, а відтак, перспективними агентами біоконтролю над ними й, можливо, тією ­«срібною кулею», що допоможе людству впоратися з бактеріальними хворобами, використавши проти бактерій їхніх природних антагоністів.

Ключові слова: антибіотикорезистентність, віруси, бактеріофаги, бактеріоз, фаготерапія.

Віруси бактерій – бактеріофаги – становлять велику групу переважно ДНК-вмісних вірусів, що є специфічними паразитами бактерій. Через тривалу коеволюцію з організмами-­господарями бактеріофаги набули здатності уникати й протистояти дії бактеріальних захисних систем. Це робить їх перспективною якщо не заміною, то альтернативою антибіотикам із фактично необмеженими можливостями біотехнологічних модифікацій їхніх властивостей для покращення ефективності лікування, враховуючи обмеження, які накладає на антибіотики їхня складна хімічна будова, і собівартість створення препаратів нового покоління.

Перші відомості про бактеріофаги з’явилися наприкінці ХІХ століття. У 1896 році британський бактеріолог Ернест Ханкін помітив, що вода ріки Ганг має бактерицидну дію, яка зникає після кип’ятіння. У 1915 році Фредерік Туорт описав біологічний агент, що уражав культури Staphylococcus aureus і викликав лізис бактеріального газону з утворенням негативних колоній-­бляшок. Знайомий із роботами Дмитра Івановського, він припустив, що виділений агент мав вірусну природу. У 1917 році Фелікс д’Ерель назвав невідомий агент бактеріофагом, що в перекладі з грецької означало ­«пожирач бактерій» (рис. 1). Усвідомлюючи значимість відкриття та можливості прикладного застосування бактеріо­фагів, д’Ерель почав використовувати їх для лікування кишкових хвороб. Його праця довела ефективність фагів, і наукові роботи, пов’язані з вірусами бактерій, почали з’являтися в медичних журналах.

Рис. 1. Ернест Ханкін (ліворуч), Фредерік Туорт (по центру), Фелікс д’Ерель (праворуч) — «батьки»-засновники напрямку фаготерапії та перші вчені, які застосували бактеріофаги для лікування хвороб

Із появою електронного мікроскопа у 1931 році й завдяки впровадженню методу електронної мікро­скопії у вірусологію в 1939 році вдалося візуалізувати віруси бактерій і довести їх приналежність до вірусів, а не до токсинів (рис. 2). Перші електронно-­мікроскопічні дослідження показали, що бактеріофаги – це гетерогенна група вірусів із різноманітними за формою, розмірами та структурою віріонами. Це лягло в основу першої систематики бактеріофагів, і здавалося, як фундаментальні, так і прикладні аспекти вивчення бактеріофагів от-от відкриють нову віху в історії медицина, але…

Рис. 2. Електронно-мікроскопічне зображення бактеріофага: 1 – головка ікосаедричного типу симетрії (вмістилище генома); 2 – хвостовий відросток та його компоненти: конектор (а), чохол (б), базальна пластинка (в) і термінальні фібрили (г)

У 1943 році Александр Флемінг випускає в серійне виробництво пеніцилін, й успіхи антибіотикотерапії відсувають подальший розвиток фаготерапії на другий план. Змагання фармацевтів за впровадження більш нових видів антибіотиків (1945 рік – тетрацикліни, 1947 рік – нітрофурани, 1952 рік – макроліди) знаменує собою початок ­золотої ери антибіотикотерапії. Але вже у 1947 році з’являються повідомлення, що деякі види бактерій втратили чутливість до пеніциліну, а проти інших його ефективність значно знизилася. Це стало першим дзвіночком для вчених і медиків, які вважали що ера бактеріальних хвороб добігає кінця і людство позбудеться їх, як завдяки вакцинації мало позбутися віспи.

Бактерії повільно набували стійкості до пеніциліну, пізніше – до тетрацикліну, ще пізніше – до макролідів та інших антибіотиків, і вже у 1980-1990-х роках стало зрозуміло, що антибіотики не вирішать проблему бактеріозів і варто розширювати спектр протибактеріальних препаратів, оскільки клінічно значимі види мікроорганізмів набували стійкості не до однієї групи препаратів, а одразу до декількох, а то й до трьох-­чотирьох, серед яких найбільше занепокоєння викликали метицилін-­резистентні штами S. aureus, карбапенем-­резистентні штами Klebsiella pneumoniae, рифампіцин-­резистентні штами Mycobacterium tuberculosis.

Водночас бактеріофаги продовжували вивчати й застосовувати, але не так широко, як антибіо­­тики. На той момент віруси були доволі складним об’єктом для вивчення, і багато механізмів їхньої взаємодії з господарями були невідомими. Однією із цих «ранніх» загадок був механізм дії бактеріофагів: чому в одних випадках вони допомагали, а в інших – ні або призводили до погіршення клінічної картини. Й Ернест Ханкін, і Фелікс д’Ерель застосовували віруси в лікуванні кишкових інфекцій, але результати терапії були неоднозначними – одні пацієнти одужували, а інші отримували тяжчу форму інфекції, що подекуди призводила до летального кінця. Лише у 1990-х роках експерименти Сальвадора Лурії пролили світло на те, які життєві цикли мають віруси бактерій і як це можна пов’язати із їхньою ефективністю як протибактеріальних агентів.

Бактеріофагам властиві два основні типи взаємодії з бактеріями: літичний і лізогенний. У першому випадку вірус проникає в клітину й руйнує її внаслідок свого розмноження. Подібні віруси вважаються найбільш перспективними у якості протибактеріальних агентів. При лізогенній взаємодії бактеріофаг проникає в клітину бактерії й, залежно від її метаболічного стану, або знищує її внаслідок продуктивної інфекції (коли бактерія мета­болічно активна), або інтегрується в її геном, щоб «перечекати» несприятливі умови існування бактерії й потім знищити якусь частину дочірніх інфікованих клітин, яким вірус передаватиметься у складі материнської ДНК.

Ці два типи взаємодії є найпоширенішими, утім найбільший інтерес викликають саме літичні віруси, оскільки вони призводять до практично повної елімінації бактерії. Разом із тим літичні фаги можуть уражати тільки ті клітини, які перебувають на стадії активного росту, тобто мають активні реплікативні системи. В іншому випадку інфікування може закінчитися абортуванням і відсутністю вірусного потомства. Відтак, літичні фаги добре працюють, коли бактерії розмножуються, і гірше – коли колонія досягає стадії плато. Це важливий момент, утім не варто забувати, що й антибіотики працюють аналогічним чином: вони ефективні тільки тоді, коли в клітині є білки-­мішені. Відповідно, інгібітори синтезу клітинних стінок, такі як β-лактами, не зможуть інгібувати їх синтез, якщо не активні DD-транспептидази, а також блокатори ДНК-гіраз і топоізомераз фторхінолони – коли немає їхніх мішеней, але вони присутні в бактеріях на стадії розмноження.

Стаціонарний період розвитку бактерій не є перешкодою для лізогенних (помірних) бактеріофагів, які здатні інтегруватися в їхні геноми й перебувати там до активації клітинного циклу або ж необмежено довго передаватися всім дочірнім клітинам бактерії, реплікуючись у складі їхніх геномів. По суті, лізо­генні бактеріофаги – це генетичні «бомби уповільненої дії», які чекають слушного моменту, щоб знищити уражену популяцію або її частину. Проблема їх застосування в якості антимікробних агентів полягає в тому, що вихід бактеріофага з геному потребує індукції, як правило – гострого клітинного стресу. Таким стресом може стати ­взаємодія з антибіотиками (тими ж фторхінолонами чи макролідами) або факторами середовища (радіація, інсоляція, прогрівання), що загрожують існуванню клітини й, відтак, вірусу. За таких умов вірус активується й руйнує всі клітини, у яких він присутній. Але головна проблема не індукція, а те, що інтегровані в геном бактеріофаги, так звані профаги, є джерелом стійкості таких бактерій-­господарів до інших вірусів (через системи попередження суперінфекції), а ще – факторами вірулентності, оскільки саме інфікування вірусом перетворює апатогенний штам бактерії на патогенний.

Деякі бактеріофаги містять у своїх геномах гени субодиниць токсинів, здебільшого генів А-субодиниці, але деякі бактеріофаги, такі як CTXφ Vibrio cholerae, фаг С1 Clostridium botulinum, фаг H-19B Escherichia coli містять цілі кластери токсинів. Для вірусу зміна поведінки господаря й здатність бактерії займати нові екологічні ніші означають появу більшої кількості пермісивних клітин, а відтак – більші шанси на відтворення, що спричиняє проблему, пов’язану зі зростанням агресивності й вірулентності бактерій.

Зважаючи на це, коли йдеться про розробку та впровадження препаратів на основі бактеріофагів, з’являються серйозні вимоги щодо того, які віруси використовувати й чи будуть ці препарати безпечними. Відповідь – будуть, оскільки на теперішньому етапі розвитку біотехнологій і діагностичних систем розробники цих препаратів можуть відслідковувати небезпечні кластери генів.

Сучасні препарати бактеріофагів – це суміші кількох різних вірусів, специфічних або щодо конкретного збудника (моновалентні), або щодо групи збудників (полівалентні). Найкращим кандидатом на роль агента фаготерапії є літичний полі­валентний вірус із значною швидкістю відтворення та адаптивністю до змін господаря. Отримати такий агент можна двома способами – шляхом довільного підбору бактеріофага з існуючої сукупності ізолятів або ж шляхом прямого виділення бактеріофага з популяції бактерії-­господаря. Унікальність бактеріо­фагів зумовлена тим, що вони завжди присутні в місцях мешкання своїх господарів. Завдання біотехнолога/вірусолога/мікробіо­­лога – виділити вірус і дослідити його на безпечність, а саме:

• здатність лізувати/лізогенізувати бактерію;
• відсутність генів токсинів/їхніх субодиниць у геномі;
• відсутність інших шкодочинних генів (антибіотикорезистентності, фазової варіативності);
• здатність блокувати виділення ендотоксинів перед лізисом клітин.

Перевірити це можна шляхом проведення аналізу ДНК вірусу на відомі маркери подібних груп генів. Якщо вірус не містить небезпечних генів, то його можна використовувати після лабораторного тестування. Важливим параметром при створенні фагових препаратів є стійкість вірусів, що впливає на термін зберігання «коктейлю», адже йдеться про цілісні біологічні об’єкти, а не хімічні сполуки. Більшість бактеріофагів – дуже стійкі й виживають усюди, де мешкають їхні бактерії-­господарі, незалежно від температури, рН та осмотичності ­середовища.

Важливою вимогою до композиції суміші є не надто велика кількість різних фагів, оскільки вони – ультраконкурентні віруси, що змагатимуться за бактерію-­господаря, знищуючи один одного, а не збудника хвороби. Також ці віруси мають долати системи захисту, створені інтегрованими в геном бактерій вірусами, інакше ефективність препарату буде низькою й недовготривалою.

Технологія отримання фагових сумішей добре відпрацьована, й існує багато сертифікованих виробництв подібних препаратів у різних країнах, включаючи Україну. Наразі фаготерапія переживає друге відродження й стрімко розвивається, щороку з’являються все нові й нові компанії, які пропонують суміші бактеріофагів, і це лише перший етап розвитку даного терапевтичного напрямку. Другий – біотехнологічно-­модифіковані віруси, що, власне, є не вірусами, а самовідтворюваними біопрепаратами: це бактеріофаги зі зміненими гено­­мами, завдання яких – не відтворювати повноцінні віріони, а поширювати інфекційну ДНК у складі ­рецептор-зв’язуючих білкових тілець. Подібні химери, які вже тестують лабораторно, демонструють значну ефективність у протидії бактеріозам. Окрім цього віруси слугують джерелом нових антибактеріальних речовин, що мають активність, порівнянну з антибіотиками, хоча, по суті, є вірусними білками, розмноженими в біореакторах. До них можна віднести лізоцими – ферменти (екзо- та ендомурамідази), що розчиняють клітинні стінки бактерій, а також протеїнові антибіо­­тики – бактеріоцини, що інгібують синтез клітинних стінок бактерій на кшталт пеніциліну, але за природою є низькомолекулярними пептидами (пептид Е у фагу φX174, L фагів MS2⁄GA, A2 фагів Qβ⁄SP). Третій шлях – поєднання бактеріофагів та анти­біотиків для підсилення ефективності обох компонентів препарату або якогось одного.

Таким чином, фаготерапія – це нова-стара зброя проти бактеріозів, що активно розвивається, і від того, як медична та наукова спільнота реагуватиме на її розвиток, залежатиме її успіх у різних країнах. Україні пощастило мати власні розробки фагових препаратів і замкнутий цикл виробництва, проте, якщо ми хочемо конкурувати на ринку в майбутньому, маємо активніше розвивати цей напрямок і не боятися бути в авангарді впровадження альтер­нативного методу лікування бактеріальних інфекцій. Несвоєчасне реагування на інновації у цій галузі може призвести до втрати можливостей створення доробку власних інновацій та підтримання реноме наукового реципієнта, яке стійко тримається за нами вже декілька десятиліть.

Фахівці центру лікування безпліддя «Medical Plaza» виступають за персоналізовану медицину, віт­чизняні інноваційні розробки та підтримку україн­ської науково-­технічної галузі. Ми активно застосовуємо й апробовуємо цю технологію в нашому центрі, пропонуємо нашим пацієнтам включати бактеріофаги до схем комплексного лікування хронічних і гострих бактеріальних інфекцій, розширюємо технологічні можливості вітчизняних виробників, створюючи запит на нові фагові суміші та препарати. Усе це дозволить Україні гідно конкурувати на ринку препаратів для боротьби з бактеріальними інфекціями та створювати тренди у цій галузі, а не рухатися тільки в фарватері світової науки та персоналізованої ­медицини.

Отже, фаготерапія – перспективний напрямок ­лікування бактеріозів, що є альтернативою антибіотикотерапії, до якої в багатьох пацієнтів уже сформована резистентність. Екологічна та еволюційна лабільність вірусів дозволяє швидко підбирати й компонувати нові фагові суміші, які можна застосовувати в різноманітних протоколах лікування. Можливість створення індивідуальних препаратів на основі вірусів дозволить значно розширити можливості персоналізованої медицини, що є вагомим кроком лікарської практики у ХХІ столітті.