сховати меню

Молекулярно-цитогенетическая диагностика в лечении пациентов с нарушением репродукции

Л.В. Тавокина, к.б.н., заведующая лабораторией генетики клиники «Исида», г. Киев

Молекулярно-цитогенетическая диагностика является современным направлением в клинической цитогенетике, цель которой – разработка и применение новых высокоэффективных методов анализа хромосомопатий. Достижения молекулярной цитогенетики в последнее десятилетие связаны с принципиально новыми подходами к диагностике наследственно обусловленной патологии и прежде всего хромосомных болезней. Это стало возможным в результате разработки и внедрения в клиническую цитогенетику комплекса новых технологий. К настоящему времени с помощью методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), обеспечивающих оплодотворение яйцеклетки вне организма в случаях невозможности такового естественным путем, рождено свыше 2 млн детей в мире.
Эти методы совершили настоящий переворот в поисках решения проблемы бесплодия и дали надежду тем супружеским парам, у которых бесплодие обусловлено генетическими факторами (изменениями в хромосомах или генах). Однако у таких пациентов бесплодие необходимо оценивать в более широком смысле – как проблему репродукции или невозможность иметь здорового ребенка. Применение ВРТ у носителей хромосомных аберраций (перестроек) или генных мутаций без учета особенностей их генотипа может стать причиной многочисленных отрицательных результатов проведения программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), повлиять на вынашивание беременности и, в конечном итоге, привести к рождению ребенка с врожденными и генетическими аномалиями.
Итак, появление ВРТ дало толчок развитию генетических аспектов диагностики как за рубежом, так и в нашей стране. В первую очередь это коснулось цитогенетических и молекулярно-цитогенетических диагностических методов.

Цитогенетические методы диагностики
Основным методом диагностики хромосомных нарушений в медицине репродукции является цитогенетическое обследование или кариотипирование. Хромосомный набор (кариотип) одинаков во всех соматических клетках организма (46 хромосом), за исключением уменьшенного вдвое набора в половых клетках. В течение всей жизни индивидуума кариотип не изменяется.
В настоящее время цитогенетическая диагностика хромосомных нарушений не вызывает особых трудностей и с появлением группы методов дифференциальной окраски хромосом практически решена. Как правило, для цитогенетического исследования необходимо лишь 2-5 мл периферической крови. Так, обратившимся в клинику ВРТ супругам, которым после тщательного осмотра и проведения клинического лабораторного обследования поставлен диагноз «первичное бесплодие неясного генеза», не следует спешить назначать процедуру ЭКО без предварительного обследования их цитогенетическими методами. Накопленный опыт показывает, что кариотипирование можно рекомендовать следующим группам пациентов, у которых имеются как мужские, так и женские факторы нарушения репродукции:
• необструктивная азооспермия;
• тяжелая олигозооспермия (<5 млн/мл);
• задержка полового развития;
• первичная аменорея;
• вторичная аменорея (преждевременная менопауза);
• в семьях с отягощенным акушерским анамнезом – привычное невынашивание, мертворождение, рождение ребенка с множественными врожденными пороками развития (МВПР).
• обследование доноров спермы и яйцеклеток.
Согласно результатам обследования супругов с репродуктивными проблемами, даже несмотря на отсутствие клинической картины (нормальный фенотип), частота хромосомных аномалий у них колеблется от 4,3 до 9,6% [2, 5]. По данным ряда авторов [ 9 ], например в группе пациентов – кандидатов на оплодотворение in vitro методом ICSI (intracytoplasmic sperm injection), этот показатель достигал 13,1%. В последнем случае показаниями для цитогенетического обследования служили мужской фактор бесплодия и неудачные попытки ЭКО. В семьях, где имеется рождение ребенка с МВПР, хромосомные нарушения встречаются в 5-15% случаев. Многочисленные данные позволяют утверждать [1, 3, 4], что наиболее часто в кариотипах пациентов с нарушением репродукции выявляются числовые и структурные аномалии хромосом типа:
1. Аномалии количества половых хромосом (синдром Клайнфельтера, синдром Тернера, трисомия по Х хромосоме и др.).
2. Сбалансированные реципрокные транслокации, при которых происходит взаимный обмен участками между негомологичными хромосомами. При сбалансированных структурных нарушениях хромосом количество представленного хромосомного материала соответствует норме, однако конфигурация хромосом нарушена.
3. Робертсоновские транслокации происходят в результате соединения двух акроцентрических хромосом (хромосомы с одним длинным плечом, короткое плечо представлено хроматином, как правило, не содержащим структурных генов). К акроцентрическим хромосомам относятся хромосомы 13, 14, 15, 21, 22.
4. Инверсии (поворот какого-либо участка в пределах одной хромосомы на 180°).
5. Маркерные хромосомы, которые не идентифицируются традиционными цитогенетическими методами и др.
6. Мозаичные варианты кариотипов с этими аномалиями.
Человек со сбалансированной перестройкой хромосом в кариотипе, как правило, не имеет фенотипических проявлений, кроме возможных проблем с воспроизводством здорового потомства. Риск самопроизвольного прерывания беременности в таких семьях составляет от 25 до 50%. В супружеских парах, где один из родителей имеет сбалансированную хромосомную аберрацию, риск рождения ребенка с несбалансированным хромосомным набором составляет в среднем от 1 до 15% [2]. Этот риск зависит от номера заинтересованных хромосом, от размера участков хромосом, включенных в перестройку, пола супруга-носителя, семейного анамнеза и метода диагностики. Важно подчеркнуть, что даже если плод унаследовал от родителей аналогичную сбалансированную перестройку, ожидать в 100% случаев рождения здорового ребенка невозможно. По причине неравного кроссинговера (от англ. сrossingover – перекрест), который представляет собой взаимный обмен участками парных хромосом, происходящий в результате разрыва и соединения в новом порядке их хроматидных нитей, может произойти перераспределение или рекомбинация сцепленных генов с каким-либо патологическим проявлением у потомства. Кроме того, такой неравный кроссинговер между нормальной хромосомой и ее аномальным гомологом может вызвать напряжение в геноме в целом. Тогда какая-либо другая хромосома может оказаться втянутой в этот процесс, что приведет к анеуплоидии, например трисомии по 21 хромосоме (синдрому Дауна) у плода, как это произошло в случае, представленном на рисунке 1.
Сбалансированная транслокация в кариотипе фенотипически здоровой матери была установлена в нашей клинике только после цитогенетического подтверждения синдрома Дауна у ребенка. По литературным данным [7], частота анеуплоидий по другим хромосомам X, Y, 13, 15, 16, 17, 18, 21 и 22 гамет, в частности сперматозоидов, существенно выше у пациентов с аномальным, хоть и сбалансированным, кариотипом.
В настоящее время для того чтобы исключить хромосомный дисбаланс как возможную причину репродуктивных проблем, кариотипирование проводится на самом современном уровне с использованием компьютерных программ хромосомного анализа, получением четкого графического изображения хромосом. Однако серьезные трудности представляют «маркерные» и «атипичные» хромосомы, не идентифицируемые обычными цитогенетическими методами, несбалансированные транслокации, интерстициальные и концевые делеции (потери) или вставки хромосомного материала и другие аномалии. Лишь в начале 90-х годов прошлого столетия с появлением молекулярно-цитогенетических методов проблема диагностики хромосомных болезней стала близка к разрешению.

Молекулярно-цитогенетические методы диагностики
Более 20 лет цитогенетические методы, базирующиеся на технике выявления продольной сегментации хромосом, оставались основными в пре- и постнатальной цитогенетике. Появление молекулярно-цитогенетических методов открыло в изучении хромосом человека и их нарушений новое измерение – субмикроскопический уровень. Метод FISH-анализа (Fluorescence in situ hybridization) позволяет обьективно выявлять индивидуальные хромосомы и их отдельные участки на метафазных пластинках (хромосомы в состоянии максимальной конденсации и визуализации) или интерфазных ядрах (деконденсированные хромосомы, без четкой морфологической структуры) на основе особенностей их молекулярно-генетического строения. Обьектом исследования в данном случае являются особенности нуклеотидного состава конкретной хромосомы или ее отдельного участка.
Классический метод FISH-анализа основан на гибридизации известной по нуклеотидному составу ДНК-пробы с участком тестируемой хромосомы и с последующим выявлением результата гибридизации по метке – флуоресцентному сигналу в ожидаемом месте. Метод FISH-анализа превратился в необходимую аналитическую процедуру в ходе цитогенетического исследования и стал востребованным сегодня в пре- и постнатальной диагностике, в мониторинге зигот после искусственного оплодотворения, в процедуре предимплантационной генетической диагностики (ПГД) в ходе селекции эмбрионов с нормальным кариотипом и т.д.
Основные преимущества FISH-анализа:
• высокая разрешающая способность (на препаратах можно выявлять те хромосомные нарушения, которые не визуализируются в обычный световой микроскоп);
• точность диагностики (размер проб может варьировать от 90-100 тыс. до нескольких миллионов пар нуклеотидов, так что в качестве мишени могут быть не только отдельные гены или хромосомные участки, но и целая хромосома).
FISH-анализ позволяет выявить, к примеру, несколько аномальных клеток среди тысяч клеток с нормальным генотипом. Все эти преимущества очень важны в обследовании супружеских пар с проблемами репродукции, т.к. хромосомные изменения в такой группе пациентов, как правило, не имеют фенотипической клинической картины.

Предимплантационная генетическая диагностика (ПГД)
Только благодаря появлению метода FISH-анализа стало возможным проведение ПГД, позволяющей выполнить генетическое тестирование эмбриона еще до переноса его в полость матки и наступления беременности. Впервые ПГД провели в 1988 г. в Лондоне, в госпитале «Хаммерсмит». С тех пор в рамках программы ЭКО уже проведено несколько тысяч таких процедур, наступили и уже благополучно закончились сотни беременностей. Достаточно широкое распространение этой манипуляции во всем мире (существует более 40 центров) привело к созданию в 2001 г. профессиональной Ассоциации по проведению ПГД.
В большинстве случаев биопсия эмбриона с целью ПГД проводится на так называемой стадии дробления (рис. 2).
Обычно на третьи сутки жизни в лабораторных условиях от нескольких эмбрионов – 7-10 (это зависит от результатов стимуляции овуляции у женщин) микроманипулятором берут один из 6-8 бластомеров. Немедленно, в течение нескольких часов, проводят FISH-диагностику на заинтересованные, согласно анамнезу супружеской пары, хромосомы или диагностику ДНК одной клетки с помощью модификаций ПЦР-метода. После этого в полость матки переносят только 2-3 генетически «здоровых» эмбриона. Очень важно отметить, что биопсия эмбриона проводится на том этапе развития, когда все его клетки-бластомеры недифференцированны, тотипотентны (totypotency – способность клеток дифференцироваться в любую из клеток взрослого организма), и поэтому возможно безопасное замещение удаленной клетки при дальнейшем дроблении оставшихся клеток. Безопасность этого метода для эмбрионов и соответственно младенца, родившегося из этого эмбриона, давно доказана. Установлено также, что биопсия эмбриона никак не повышает вероятности пороков развития человека, родившегося из этого эмбриона. Однако необходимо учитывать, что в ходе диагностики на эмбрион оказывается дополнительное воздействие, которое несколько снижает вероятность наступления беременности по сравнению с вероятностью беременности в классической программе ЭКО.
Предимплантационная диагностика позволяет значительно увеличить эффективность лечения методами ВРТ пациентов, страдающих бесплодием, а также предотвратить рождение ребенка с наследственным заболеванием [6, 8, 10, 11]. Выявление генетического заболевания у плода методами инвазивной пренатальной диагностики предполагает необходимость прерывания беременности; доимплантационная диагностика преследует цель наступления беременности изначально здоровым плодом. Степень риска беременности больным плодом определяется в каждом конкретном случае при медико-генетическом консультировании.
Проведение ПГД показано:
1. Носителям и больным хромосомными или генными заболеваниями с целью уменьшения риска рождения ребенка с генетической патологией:
• пациентам с мозаичными вариантами синдромов Клайнфельтера, Тернера и др.;
• носителям Робертсоновских транслокаций, маркерных хромосом, сбалансированных и др. перестроек в кариотипе;
• лицам с моногенными заболеваниями или носителям этих заболеваний (муковисцидоза, гемофилии, болезни Гентингтона, мышечной дистрофии Дюшена и др.).
2. Для увеличения эффективности программы ЭКО с помощью «отсева» эмбрионов с числовыми аномалиями в кариотипе, которые выявляются более чем у половины рутинно переносимых эмбрионов:
• женщинам в возрасте старше 35 лет;
• лицам с плохим прогнозом ЭКО (три и более спонтанных прерываний беременности на ранних сроках);
• пациентам с тремя и более неудачными попытками IVF/ICSI;
• мужчинам с тяжелыми нарушениями сперматогенеза.
Кроме того, с помощью метода ПГД стало возможным:
• выявление «эмбрионов-носителей» болезней с поздней манифестацией и генетической предрасположенностью к тяжелым заболеваниям (онкология, болезнь Альцгеймера и т.д.);
• проведение HLA (human leukocyte antigen) – типирование эмбрионов для подбора донора, идентичного по лейкоцитарному антигену больному ребенку – брату/сестре;
• определение пола эмбриона для предотвращения передачи заболевания, сцепленного с полом.
По всей видимости, вышеуказанный перечень генетических заболеваний будет постоянно увеличиваться по мере развития самой техники ПГД и в силу тех возможностей, которые она открывает. Так, например, российские коллеги из клиники «Мать и дитя» сообщили, что недавно исполнилось шесть месяцев первым детям, рожденным в России после ЭКО, в ходе которого была проведена ПГД на муковисцидоз. Исследования педиатров и генетиков подтвердили, что близнецы совершенно здоровы. Известно, что муковисцидоз – смертельно опасное заболевание, при котором резко повышается вязкость слизи дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, нарушается работа многих внутренних органов. Средняя продолжительность жизни больных – 16-18 лет, причем все это время дети находятся на постоянном и интенсивном лечении. Болезнь передается по наследству и вызывается мутацией всего одного гена муковисцидоза – CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), – расположенного в хромосоме 7. В настоящее время известно уже несколько тысяч мутаций этого гена, что вызывает огромные сложности в диагностике данного заболевания.
В клинике «Исида» вот уже в течение трех лет проводится доимплантационная диагностика супругам с проблемами репродукции. Представляем вашему вниманию два случая с благополучным рождением здоровых детей.
Случай 1. В клинику обратилась женщина с отягощенным акушерским анамнезом (три беременности, замершие на ранних сроках). До этого в течение 10 лет лечилась в различных клиниках ВРТ, прошла несколько неудачных попыток ЭКО. Забеременеть она смогла только после проведения в нашей клинике полного молекулярно-цитогенетического обследования, включающего кариотипирование самой пациентки с точной идентификацией методом FISH-анализа аномальной лишней хромосомы, которая присутствовала в ее кариотипе (рис. 3а, б). Методом выбора при такой хромосомной аномалии могла быть только ПГД (как альтернативный метод донации ооцитов). Селекция нормальных эмбрионов была произведена на стадии 8 бластомеров. В полость матки перенесены только те эмбрионы, которые не содержали аномальной хромосомы (рис. 3в) .
Случай 2. Супружеская пара наблюдалась в клинике по поводу бесплодия. В анамнезе – несколько неудачных попыток ЭКО. Цитогенетическое обследование показало у обоих супругов нормальный кариотип (у мужа – 46, XY, у жены – 46, ХХ). Однако беременность не наступала. Для увеличения эффективности программы ЭКО за счет «отсева» эмбрионов с числовыми аномалиями в кариотипе супругам была рекомендована процедура ПГД (рис. 4). Она была успешно проведена. Среди всех бластомеров, взятых по одному от каждого из 7 эмбрионов, 3 были с нормальным набором хромосом, а остальные 4 – с анеуплоидиями в кариотипе (моносомия по Х, дисомии по Х и Y хромосомам). Лучшие эмбрионы были перенесены в полость матки; наступила долгожданная беременность с последующим рождением в срок здоровой девочки.
Однако следует помнить, что ввиду сложности изначального генетического диагноза пациенткам после процедуры ПДГ показано ведение наступившей беременности с применением пренатальных скрининговых программ, а при необходимости – проведение пренатальной инвазивной диагностики. Это обусловлено тем, что FISH-метод с пробами ДНК к наиболее часто встречающимся анеуплоидиям по 13, 18, 21, Х, Y хромосомам не исключает возникновения каких-либо других структурных или числовых перестроек в кариотипе плода (хотя de novo такие изменения случаются крайне редко).
Теоретически ПГД можно выполнить на любое наследственное заболевание, для которого полностью определена хромосомная аномалия или структура гена (его расположение на хромосоме и мутация, приводящая к данному заболеванию). Количество заболеваний, которые уже исследованы с помощью ПГД, приближается к 100. Кандидатом на ПГД является любая семейная пара, у которой повышен риск передачи ребенку наследственных заболеваний. Однако для того чтобы такая диагностика могла быть успешно проведена, ей должно предшествовать полное цитогенетическое, а при необходимости – молекулярно-цитогенетическое обследование супругов.
В завершение следует отметить, что крайне сложная методика ПГД постепенно становится если не рутинной, то все более и более привычной, однако не настолько, чтобы ее можно было выполнить в любой клинике, т.к. она требует высокого качества реактивов, микроскопов с высокой разрешающей способностью и соответствующими компьютерными программами для анализа получаемых изображений. Выполнить все эти требования можно только в оборудованной по последнему слову современных репродуктивных технологий клинике, где работают профессионалы высокого уровня.

Литература
1. Ворсанова С.Г., Казанцева Л.З., Берешева А.К., Демидова И.А. Результаты молекулярно-цитогенетической диагностики супружеских пар с нарушением репродуктивной функции при медико-генетическом консультировании // Молекулярная диагностика наследственных болезней и медико-генетическое консультирование: Республиканский сб. науч. тр. – М.,1995. – С. 124-131.
2. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Чернышов В.Н. Хромосомные синдромы и аномалии. Классификация и номенклатура. // Ростов-на-Дону, 1999. – С. 107-112.
3. Политко А.Д., Лазюк Г.И. Цитогенетические особенности носителей сбалансированных конституциональных перестроек хромосом // Здравоохранение. Минздрав республики Беларусь. – 1998. – № 1. – С. 16-18.
4. Стефанович Г.В., Бутенко В.Л., Бариляк І.Р. Цитогенетичні дослідження статевих та соматичних клітин при безплідді // ІІІ з’їзд медичних генетиків України: Тези доп. – Львів, 2002. – С. 36.
5. Gekas J., Thepot F., Turleau C., Siffroi J.P., Dadoune J.P., Wasels R., Benzacken B. and the Association des Cytogeneticiens de Laugue Francaise. Chromosomal factors of infertility in candidate couples for ICSI an equal risk of constitutional aberrations in women and men // Human Reprodaction. 2001. – V. 16. – № 1. – P. 82-90.
6. Gianaroli Luca. Preimplantation genetic diagnosis: polar body and embryo biopsy // Human Reproduction, 2000. – Vol. 15 (Suppl. 4). – P. 69-75
7. R. Mikelsaar, J. Lissitsina, M. Punab. Cytogenetic analyses of families with fertility problems // congress/Lab Med. – 2006. – № 1. – P. 171.
8. Steptoe P.C., Edwards R.G. Birth after reimplantation of a human embryo. Lancet 1978; 2: 366
9. Peschka B., Leygraaf J., K.van der Ven, Montag M., Schartmann B., Schubert R., Van der Ven H. and Schwanitz G.. Type and frequency of chromosome aberrations in 781 couples undergoing intracytoplasmic sperm injection // Human Reprodaction. 1999. – V. 14. – № 9. – P. 2257-2263.
10. Scriven P.N., Flinter F.A., Braude P.R., Mackie Ogilvie C. Robertsonian translocations-reproductive risks and indications for preimplantation genetic diagnosis // Human Reproduction, 2001. – Vol. 16. – N 11. – P. 2267-2273.
11. Stern C., Pertile M., Norris H., Hale L., G. Baker H.W. Chromosome Translocations I couples with in-vitro fertilization implantation failure // Human Reprodaction. 1999..– V. 14. – N 8. – P. 2097-2101.

Наш журнал
у соцмережах:

Випуски за 2007 Рік

Зміст випуску 6 (9), 2007

  1. А.Д. Дюдюн, Н.Н. Полион, Т.Н. Полишко, А.Е. Нагорный, М.А. Довбыш, С.А. Дюдюн, С.В. Захаров

  2. А.Д. Дюдюн, Н.Н. Полион, Т.Н. Полишко, А.Е. Нагорный, М.А. Довбыш, С.А. Дюдюн, С.В. Захаров

  3. А.Д. Дюдюн, Н.Н. Полион, Т.Н. Полишко, А.Е. Нагорный, М.А. Довбыш, С.А. Дюдюн, С.В. Захаров

  4. А.Д. Дюдюн, Н.Н. Полион, Т.Н. Полишко, А.Е. Нагорный, М.А. Довбыш, С.А. Дюдюн, С.В. Захаров

  5. А.Д. Дюдюн, Н.Н. Полион, Т.Н. Полишко, А.Е. Нагорный, М.А. Довбыш, С.А. Дюдюн, С.В. Захаров

  6. А.Д. Дюдюн, Н.Н. Полион, Т.Н. Полишко, А.Е. Нагорный, М.А. Довбыш, С.А. Дюдюн, С.В. Захаров

  7. А.Д. Дюдюн, Н.Н. Полион, Т.Н. Полишко, А.Е. Нагорный, М.А. Довбыш, С.А. Дюдюн, С.В. Захаров

  8. А.Д. Дюдюн, Н.Н. Полион, Т.Н. Полишко, А.Е. Нагорный, М.А. Довбыш, С.А. Дюдюн, С.В. Захаров

  9. А.Д. Дюдюн, Н.Н. Полион, Т.Н. Полишко, А.Е. Нагорный, М.А. Довбыш, С.А. Дюдюн, С.В. Захаров

  10. А.Д. Дюдюн, Н.Н. Полион, Т.Н. Полишко, А.Е. Нагорный, М.А. Довбыш, С.А. Дюдюн, С.В. Захаров

  11. А.Д. Дюдюн, Н.Н. Полион, Т.Н. Полишко, А.Е. Нагорный, М.А. Довбыш, С.А. Дюдюн, С.В. Захаров

  12. А.Д. Дюдюн, Н.Н. Полион, Т.Н. Полишко, А.Е. Нагорный, М.А. Довбыш, С.А. Дюдюн, С.В. Захаров

Зміст випуску 4 (7), 2007

  1. О.М. Барна

  2. О.М. Барна

  3. О.М. Барна

  4. О.М. Барна

  5. О.М. Барна

  6. О.М. Барна

  7. О.М. Барна

  8. О.М. Барна

  9. О.М. Барна

  10. О.М. Барна

  11. О.М. Барна

  12. О.М. Барна

Зміст випуску 3 (6), 2007

  1. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  2. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  3. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  4. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  5. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  6. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  7. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  8. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  9. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  10. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  11. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  12. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  13. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  14. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  15. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  16. В.А. Товстановская, И.В. Ус

  17. В.А. Товстановская, И.В. Ус

Зміст випуску 2 (5), 2007

  1. М.В. Майоров

  2. М.В. Майоров

  3. М.В. Майоров

  4. М.В. Майоров

  5. М.В. Майоров

  6. М.В. Майоров

  7. М.В. Майоров

  8. М.В. Майоров

  9. М.В. Майоров

  10. М.В. Майоров

  11. М.В. Майоров

  12. М.В. Майоров

  13. М.В. Майоров

  14. М.В. Майоров

  15. М.В. Майоров

  16. М.В. Майоров

  17. М.В. Майоров

Зміст випуску 1 (4), 2007

  1. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  2. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  3. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  4. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  5. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  6. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  7. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  8. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  9. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  10. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  11. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  12. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  13. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  14. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  15. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

  16. С.А. Масюкова, В.В. Гладько, М.В. Устинов, Ю.С. Егорова

Випуски поточного року

Зміст випуску 1 (153), 2024

  1. В.І. Пирогова

  2. Д.О. Птушкіна

  3. О.О. Ковальов, К.О. Ковальов

  4. О.О. Ковальов