Використання вітрифікованих ембріонів для запліднення

Cучасний розвиток медичних технологій сприяє розробці все нових підходів до лікування безпліддя. Так, широкого застосування у клінічній практиці набув один із методів допоміжних репродуктивних технологій – кріоконсервація сперматозоїдів, ооцитів, ембріонів. Цей метод певною мірою сприяє вирішенню проблеми збереження та подальшого використання біологічного матеріалу, що залишається невикористаним під час проведення циклів запліднення in vitro. Адже при низьких температурах ембріони зберігаються в життєздатному стані, їхня метаболічна активність не порушується, а ефективність використання, тобто рівень імплантації, не поступається програмам запліднення in vitro з використанням свіжих зразків біоматеріалу [3, 4].
У світовій медичній практиці накопичено значний досвід досягнення вагітності шляхом розморожування та запліднення зрілих ооцитів [2, 6, 1]. Донедавна як кріопротектор використовували реагент диметилсульфоксид (DMSO) і схему повільного охолодження та швидкого відтавання. Згодом почали застосовувати пропандіол (PROH), а відтак – комбінацію пропандіолу й сахарози, що перетворилась у перший комерційний набір середовищ для заморожування й відтавання ооцитів датської фірми MediCult.
Разом з тим технологія заморожування ооцитів все ще недостатньо відпрацьована, а тому її вдосконалення залишається актуальною проблемою, що потребує подальшого вирішення. Труднощі кріоконсервації зрілої яйцеклітини пов’язані зі значним об’ємом її цитоплазми; високим умістом води в клітині; станом хромосом, що перебувають у метафазі мейозу і дуже чутливі до температурних та осмотичних коливань під час заморожування, та (що є найважливішим) відтавання [5].
Основною причиною пошкодження клітин при заморожуванні й відтаванні є процес утворення кристалів льоду всередині клітини. Здавалося б, що зневоднення клітини може вирішити цю проблему, але видалення надто великого об’єму води також вважається руйнівним для клітини.
Відомо, що температура замерзання води, в якій містяться різні іони, є нижчою 0 °С і залежить від іхньої концентрації. Під час кріоконсервації клітини частина молекул води піддається кристалізації, що підвищує концентрацію розчину й тим самим знижує температуру заморожування. Зростання в клітині рівня осмотичного тиску також має руйнівну дію. На сьогоднішній день однозначно доведено, що чинником ушкодження клітин є не низька температура, а кристали льоду, що утворюються в певних температурних зонах під час заморожування й відтавання.
Процес глибокого заморожування матеріалу відбувається здебільшого двома способами:
1. Методом повільної кріоконсервації.
2. Методом незбалансованої кріоконсервації, що складається:
• з ультрашвидкої кріоконсервації;
• з вітрифікації.
Метод повільної кріоконсервації, що здійснюється поетапно, є найбільш розповсюдженим способом заморожування людських ембріонів. При повільному покроковому охолодженні відбувається дегідратація клітин, що сприяє зменшенню ризику утворення великих внутрішньоклітинних кристалів льоду. Завдяки наявності осмотичного градієнта кріопротектори «витягують» з клітини воду, яка замерзає в міжклітинному просторі. З метою запобігання спонтанному утворенню льоду застосовують ручний сідинг (seeding). Пінцетом доторкаються до соломинки, що містить розчин з клітинами при температурі -6,5 °С, з подальшою десятихвилинною експозицією при температурі кристалізації. Відтак при температурі -35 °С ембріони поміщають у рідкий азот, де проходить завершальна стадія заморожування і де ембріони зберігатимуться до використання. Однак ризик пошкодження ембріонів внаслідок між- та внутрішньоклітинної кристалізації залишається досить високим. Окрім того, метод повільної кріоконсервації здійснюється за допомогою спеціальної апаратури, вартість якої висока.
Метод ультрашвидкої кріоконсервації полягає в наступному. Ембріони, які знаходилися в розчині диметилсульфоксиду та сахарози, переносять у рідкий азот; дрібні кристали льоду, що утворюються, згодом тануть при більш низьких температурах.
Метод вітрифікації (від лат. vitrum – скло) полягає в перетворенні рідини до твердого стану внаслідок процесу екстремального підвищення в’язкості клітини під час охолодження, а не кристалізації, тобто вітрифікація – це заморожування без утворення кристалів льоду. При вітрифікації значно спрощується не тільки процес охолодження, але й зникає небезпека фізичних і хімічних пошкоджень, викликаних між- та внутрішньоклітинною кристалізацією. Цей метод здійснюється за допомогою вітрифікаційної рідини, що складається з двох видів кріопротекторів:
• розчину з високою концентрацією кріопротектора, здатного проникати крізь мембрану клітини (пропіленглюколь, гліцерол, етиленглюколь);
• розчину малопроникливого кріопротектора для забезпечення дегідратації клітин (поліетиленглюколь, фікол, сахароза).
Концентрація кріопротектора є настільки високою, що при надто швидкому охолодженні до -196 °С в’язкість рідини сильно зростає.
Важливо, що для вітрифікації, на відміну від повільної кріоконсервації, застосовують одні й ті самі розчини, незалежно від стадії розвитку ооцитів чи ембріонів.
Практично, процес вітрифікації полягає в розміщенні ооцитів чи ембріонів у вітрифікаційному середовищі, але на дуже короткий час з метою запобігання токсичній дії внаслідок подальшого надшвидкого заморожування.
Отже, метод вітрифікації не потребує значних матеріально-технічних витрат, і є зручним для практичного застосування. Під час вітрифікації значно спрощується процес охолодження, що запобігає розвитку фізичних і хімічних пошкоджень клітин унаслідок утворення між- та внутрішньоклітинних кристалів.
На базі кафедри акушерства та гінекології Боннського університету (Німеччина) освоєно і впроваджено в клінічну практику метод асептичної вітрифікації. У цій публікації повідомляємо про перший випадок в Україні успішної вагітності, що настала після ембріотрансферу вітрифікованих ембріонів.
Пацієнтка Г.К., віком 30 років, звернулася до медичного центру «Інтерсоно» з приводу вторинного безпліддя з наявністю чоловічої патології як превалюючого чинника. Контрольовану гіперстимуляцію яєчників проводили за стандартним довготривалим протоколом. Як агоніст гонадотропін-рилізінг гормону з метою десинтизації гонадотрофів гіпофіза використали Декапептил (Ferring) у дозі 0,1 мг з 21-го дня попереднього менструального циклу(МЦ) до дня, що передує призначенню тригера овуляції Хорагону в дозі 10 тис МО. Стимуляція яєчників проведена сМГ Менопуром, сумарна доза якого становила 2100 МО. У результаті аспірації фолікулів було отримано 7 ооцитів, з яких два – незрілі: один на стадії першого поділу мейозу (МI), другий – на стадії зародкового пухирця (GV). П’ять зрілих ооцитів на стадії метафази II (МII) були запліднені методом інтрацитоплазматичного введення одного сперматозоїда. Для запліднення було використано кріоконсервовану сперму донора з банку сперми «Імплант».
Через 17 год після запліднення у всіх 5 ооцитів візуалізувалося по два пронуклеуса, що свідчило про вдале запліднення.
На момент ембріотрансферу на 72-й годині культивування два ембріона досягли стадії 5 бластомерів, один – 6, ще один – 8 бластомерів, одна зигота не поділилася. Ембріотрансфер чотирьох ембріонів було здійснено без ускладнень.
На 14-й день після ембріотрансферу, за даними якісного аналізу гормону ХГЛ у сироватці, був отриманий позитивний результат. Однак подальше ультразвукове дослідження (УЗД) не підтвердило вагітності.
Під час другого циклу екстракорпорального запліднення було аспіровано 14 ооцитів, один з яких знаходився на стадії МI.
Контрольовану гіперстимуляцію яєчників проводили за стандартним тривалим протоколом. Як агоніст гонадотропін-рилізинг гормону при другій спробі було використано Декапептил-депо в дозі 3,75 мг, що був призначений на 21-й день попереднього МЦ внутрішньом’язово. Стимуляцію яєчників проводили за допомогою сМГ Менопуру, сумарна доза якого становила 2400 МО.
Наступної доби після запліднення в 9 ооцитах візуалізувалося по два пронуклеуса, через 48 год після запліднення 4 ембріони були відібрані для подальшого ембріотрансферу, а 5 – на стадії двох-чотирьох бластомерів були кріоконсервовані методом асептичної вітрифікації. Вітрифікація складалася з наступних етапів:
• Перший етап – східчаста прееквілібрація ембріонів у розчині з високою концентрацією кріопротектора, здатного проникати крізь мембрану клітини, та в розчині з малопроникливим кріопротектором; з подальшим переносом ембріонів у вітрифікаційний розчин з фінальною концентрацією кріопротекторів.
• Другий етап – ембріони за принципом капілярності поміщають у носії – відкриті витягнуті соломки (ВВС), які потім занурювали в рідкий азот для зберігання. З метою запобігання прямого контакту вітрифікованих ембріонів з рідким азотом ВВС встановлювали в спеціально підготовані соломинки, які закривалися металевою кулькою.
На третю добу культивування, тобто на момент ембріотрансферу, один ембріон досягнув стадії 8 бластомерів, два – 6 бластомерів і один – трьох. Всі чотири ембріони категорії А і В було внесено в порожнину матки, але вагітність не наставала.
У лютому 2006 р. жінці був проведений ембріотрансфер вітрифікованих ембріонів, які напередодні були розморожені й перенесені до середовища для культивування ISM 1 (фірма MediCult, Данія). Процедура відтавання здійснювалася в три етапи.
1. Перенесення ембріонів з носія (ВВС) до розчину сахарози максимальної концентрації.
2. Ступінчасте їх очищення від кріопротекторів у розчинах сахарози, концентрація яких поступово знижувалася.
3. Фінальне відмивання, перенесення ембріонів в культуральне середовище та вирощування в умовах СО₂-інкубатора.
Всі п’ять ембріонів добре пережили процедуру відтавання й на момент ембріотрансферу в порожнину матки були на стадії трьох-п’яти бластомерів.
На 28-й день після ембріотрансферу під час контрольного УЗД було діагностовано одноплідну вагітність, яка успішно завершилася пологами на 39-му тижні вагітності в листопаді 2006 р. народженням дівчинки.
Таким чином, вітрифікацію в програмах екстракорпорального запліднення можна розглядати як альтернативу протоколу повільного заморожування.
Сподіваємося, що в найближчому майбутньому буде однозначно доведено перевагу вітрифікації над повільним заморожуванням.

Література
1. Cher C. Pregnancy after human oocyte cryopreservation // Lancet. – 1986. – №19. – Р. 884-886.
2. Fabbri R., Porcu E., Marselle T. et al. Human oocyte cryopreservation: new perspectives regarding oocyte survival. Human Reproduction 2000;16; 411-416.
3. Fidler S., Raziel A., Soffer Y. Intracytoplasmic injection of fresh and cryopreserved testicular spermatozoa in patients with nonobstructive azoospermia – a comparative study. Fertility Sterility 1997; 68; 892-897.
4. Gil-Salmor M., Romeo J., Mingues Y. Pregnancies after cytoplasmic sperm injection with with cryopreserved testicular spermatozoa. Human Reproduction 1996; 11; 1309-1313.
5. Poirot C., Vacher- Lavenu M. – C., Helardot P. et al. Human ovarian tissue cryopreservation: indications and feastibility. Human Reproduction 2002;17(6): 1447-1452.
6. Porcu E., Fabbri R., Seracchioli R. et al. Birth of healthy female after ICSI of cryopreserved human oocytes. Fertility Sterility 1997; 68; 724-726.