Генетические аспекты преждевременного истощения яичников

В настоящей работе рассматриваются клинические и генетические аспекты патогенеза преждевременного истощения яичников (ПИЯ). В группах пациенток с ПИЯ и доноров яйцеклеток с использованием методов ДНК-анализа проведено исследование мутации 769G->A гена INHα1 и аллельного полиморфизма области СGG-повторов в гене FMR1. Полученные данные стали новым доказательством вовлечения генов FMR1 и INHα1 в регуляцию функционального резерва яичников. В результате исследования сделан вывод о необходимости проведения тестирования мутаций генов INHα1 и FMR1 у молодых женщин с целью раннего выявления риска развития ПИЯ и планирования рождения ребенка. Такая программа генетического тестирования может быть важной для выбора стратегии стимуляции овуляции у пациенток с бесплодием, которые проходят лечение методом экстракорпорального оплодотворения, а также для доноров яйцеклеток.

Яичник – уникальный орган женщины, функционирование которого прекращается задолго до конца ее жизни. Именно в тот период, когда количество фолликулов в яичнике достигает определенной критической величины (от 100 до 1000), прекращается их созревание и наступает физиологическая менопауза. Средний возраст женщин, когда они достигают менопаузы, в норме около 50 лет, почти у 1% женщин – к 60-и годам и у 1-2% – до 40 лет [1, 2]. Раннее наступление менархе или выключение функции яичников формируют симптомокомплексы, при которых в патологический процесс вовлекаются не только органы репродукции, но и системы, чутко реагирующие на изменение уровней половых гормонов. В настоящее время все эстроген-дефицитные состояния, при которых уровень Е₂ в крови составляет 80 пмоль/л и менее, в зависимости от поражений репродуктивной системы подразделяют на нарушения центрального и яичникового генеза. Именно о последнем образно выразился Н. Wollett: «Преждевременная менопауза выбивает женщину из марафонского забега задолго до ожидаемого финиша» [3].

Cимптомокомплексы, формирующиеся у женщин моложе 40 лет и проявляющиеся вторичной аменореей, признаками выраженной гипоэстрогении и бесплодием на фоне повышенного уровня гонадотропинов – ФСГ (фолликулостимулирующий гормон), ЛГ (лютеонизирующий гормон), принято называть преждевременным истощением яичников. Иногда в литературе используют иные термины: «преждевременная недостаточность яичников» (ПНЯ), «преждевременное выключение функции яичников» (ПВФЯ), «преждевременная менопауза» (ПМ).

На основании проведенных исследований ПИЯ относили к необратимым состояниям. В 1969 г. G. Jones и М. de Morales-Ruehsen описали троих пациенток с вторичной аменореей, бесплодием, высоким уровнем гонадотропинов и сохраненным фолликулярным аппаратом, у которых крайне редко возникали самостоятельные менструации [4]. Подобное состояние было охарактеризовано, как синдром резистентных яичников, или Савадж-синдром – по имени одной из пациенток [5]. Для этой клинической ситуации C. О’Herlity и соавт. предложили термин «скрытая форма ПИЯ» [6].

Современные исследователи полагают, что ПИЯ может развиться вследствие снижения фолликулярного пула, которое обусловлено нарушениями фолликулогенеза и ускорением процесса апоптоза и атрезии фолликулов. ПИЯ становится большой проблемой для семейных пар, если женщина откладывает создание семьи на поздний период, когда у нее уже развилось бесплодие. Кроме того, у женщин с ПИЯ возникают патологические процессы, которые в молодом возрасте связаны с гипоэстрогенией, что является фактором риска развития остеопороза и коронарной сердечной недостаточности [7]. Анализ становления менструальной функции, продолжительности менструального цикла у пациенток с ПИЯ не выявил каких-либо особенностей, которые в пубертатном и юношеском возрасте могли бы настораживать в отношении повышенного риска развития в дальнейшем преждевременного снижения функции яичников. Наиболее частыми причинами, которые приводят к формированию яичниковой недостаточности, считают стрессовые ситуации. По мнению A. Vermeulen, хронический стресс относится к ведущим повреждающим факторам, воздействующим на эндокринные железы [8]. Индивидуальное восприятие повышенных физических и психических нагрузок может изменять регуляторную функцию иммунной системы и через повышение уровня кортикостероидных гормонов оказывать влияние на гипоталамо-гипофизарно-яичниковую ось. Преждевременное выключение функции яичников с исходом в гипергонадотропный гипогонадизм, в конечном итоге, приводит к изменению функционирования гипоталамической и лимбической систем и секреции нейрогормонов. В результате этого снижается активность допаминергических и повышается активность норадренергических структур, вследствие чего снижается уровень эндорфинов, серотонина, допамина, изменяется терморегуляция, появляются приливы, гипергидроз, развиваются гипертензия и ожирение.

Установлено, что химио- или радиотерапия резко уменьшают число фолликул и могут вызывать ПИЯ. Несмотря на то, что аутоиммунные заболевания отмечаются у 10-20% женщин с ПИЯ, роль аутоиммунных процессов, некоторых инфекций в развитии патологии остается не до конца изученной [7]. Другими факторами развития ПИЯ могут быть такое заболевание, как галактозимия, недостаток отдельных ферментов и нарушение сигнальной системы гонадотропина [9].

Установлено, что ПИЯ имеет наследственную природу, этому способствует существование наследственных генетических дефектов. Число женщин с ПИЯ и женщин, которые имеют семейный анамнез, в разных исследованиях существенно отличается (от 5 до 37,5%), что можно объяснить неоднородностью популяционных групп пациенток с ПИЯ [10]. Известно, что ПИЯ может наследоваться как по отцовской, так и по материнской линии, по аутосомально-рецессивному и Х-сцепленному типу наследования с неполной пенетрантностью [11-14].

У женщин с ПИЯ описаны и хромосомные абберации, которые, в основном, наблюдали на Х-хромосоме, эти нарушения могут приводить к полной делеции или частично нарушать отдельные гены, важные для репродукции, а также процесс инактивации Х-хромосомы либо опосредованно воздействовать на спаривание хромосом во время мейоза.

Предполагается, что генами-кандидатами, локализованными на Х-хромосоме, нарушение которых и обусловливает ПИЯ, являются гены POF1, POF2 и FMR1, а местом локализации других генов-кандидатов ПИЯ считается 3-я хромосома (регион 3q22-3q23) [14]. Возможными генами-кандидатами патогенеза ПИЯ считаются гены семейства ингибинов. Таким образом, генетическая природа ПИЯ определяется мутациями в различных генах, которые приводят к подобным фенотипическим признакам. Вот почему важно выяснить роль конкретного генетического фактора при обследовании отдельного пациента.

Как мы уже отмечали, одним из генов-кандидатов, детерминирующим развитие ПИЯ, является ген FMR1, изучение его изначально было связано с синдромом ломкой Х-хромосомы (синдром Мартина-Белла). Данная наследственная патология – наиболее распространенная после синдрома Дауна и генетически обусловленная форма умственной отсталости, частота которой составляет 1 на 1500 новорожденных мальчиков и 1 на 2500 девочек [15, 16]. Задержка развития психомоторных функций и умственная отсталость – наиболее важные клинические признаки синдрома ломкой Х-хромосомы. Развитие данной патологии связано с так называемой динамической мутацией – гиперэкспансией тринуклеотидных CGG-повторов, локализованных в 5’ нетранслируемой области гена FMR1 (fragile X mental retardation) [17, 18].

Когда количество копий повторов превышает 200, происходит гиперметилирование последовательности ДНК ближайшего СpG-островка. Считается, что именно это приводит к выключению транскрипционной активности гена и остановке синтеза соответствующего белка FMRP (fragile X mental retardation protein) [18,19], данный белок является РНК-связывающим [20]. Важно отметить, что РНК-связывающие белки играют большую роль в клеточных процессах как в ядре, так и в цитоплазме, регулируют посттранскрипционную экспрессию генов, инициируя регуляцию сплайсинга про-мРНК, поддерживают стабильность мРНК, влияют на эффективность трансляции, а возможно, и регулируют транспорт РНК между ядром и цитоплазмой [21]. Некоторые РНК-связывающие белки могут функционировать как ДНК-связывающие и регулировать транскрипцию специфических генов. При изучении пациентов с синдромом ломкой Х-хромосомы было обнаружено, что белок FMRP играет важную роль в пролиферации половых клеток, о чем свидетельствует высокий уровень его экспрессии в сперматогониях. С другой стороны, среди родственниц пациенток с синдромом Мартина-Белла были выявлены специфические фенотипы, не характерные для данного заболевания, в частности ПИЯ и другие нарушения функции яичников. Следует отметить, что в области CGG-повторов гена FMR1 возникают так называемые динамические мутации. Суть этого явления заключается в том, что у потомков конкретного индивида в поколении может меняться количество копий CGG-повторов. У матерей и сестер, больных синдромом Мартина-Белла, определяют премутацию, которая варьирует от 50 до 199 повторов. Полная же мутация, как отмечалось выше, составляет 200 и более повторов, наименьший размер аллеля, который в следующем поколении может превратиться в полную мутацию, – не менее 59 CGG-повторов [22]. Cуществуют так называемые промежуточные аллели, которые потенциально нестабильны в процессе наследования, минимальный размер таких аллелей риска варьирует от 39 до 41 CGG-повтора.

В ходе недавно проведенных исследований были получены данные о том, что приблизительно у 20% женщин-носительниц премутации выявляют ПИЯ. Интересно отметить, что по результатам этих исследований женщины-носительницы полной мутации имеют одинаковый риск развития ПИЯ (1%) с женщинами, не имеющими премутации. Также было установлено, что даже те носители премутации, у которых цикл не нарушается, имеют более высокий уровень ФСГ по сравнению с носителями полной мутации или неносителями премутации [23, 24]. Кроме того, выявлена связь между развитием ПИЯ и происхождением премутантного аллеля от одного из родителей. Так, установлено, что большинство женщин-носительниц премутации в гене FMR1, у которых развивалось ПИЯ, унаследовали мутантный аллель от отца и лишь в редких случаях – от матери [25]. В широкомасштабном исследовании подтверждена статистически достоверная ассоциация между увеличением размера области CGG-повторов гена FMR1 и развитием нарушения функции яичников [26]. Исходя из полученных данных по исследованию ассоциации между мутантными вариантами гена FMR1 и недостаточностью функции яичников, можно сделать вывод о том, что экспрессия белка FMRP играет существенную роль в формировании физиологического резерва яичников, а тестирование CGG-области гена FMR1 у пациенток с ПИЯ и другими формами патологии яичников важно как с точки зрения выяснения тонких молекулярно-генетических механизмов патологического процесса, так и для ранней диагностики заболевания у пациенток с высоким риском развития ПИЯ.

Другим потенциальным «кандидатом», влияющим на развитие наследственных форм ПИЯ, является ген ингибина. Ингибин и активин – мультифакторные гормоны, входящие в семейство белков факторов роста , они ингибируют и стимулируют синтез и секрецию ФСГ [ 26-32].

Синтез трех субъединиц ингибина (α, β_A и β_B) происходит только в гранулярных клетках яичника на ранних стадиях формирования фолликулов [33]. У женщин основная функция ингибина – регуляция секреции ФСГ – снижение концентрации ингибина в сыворотке крови отмечается при уменьшении резерва фолликулов в яичнике [34]. C другой стороны, повышение концентрации ФСГ совпадает со степенью фолликулярного истощения при переходе к менопаузе [35]. Именно поэтому нарушения (мутации) гена INHα1, которые обусловливают уменьшение уровня биоактивного ингибина и, в свою очередь, повышают концентрацию ФСГ по принципу негативной регуляции, приводят к первичному истощению фолликулов и в результате – к ПИЯ.

Миссенс – мутация 769G->A (замена во 2-м экзоне гена) – встречается примерно у 7% пациенток с ПИЯ, развивается в очень раннем возрасте [36]. Предполагается, что эта мутация нарушает связывание ингибина и с рецептором и, таким образом, ослабляет активацию ингибина и нарушает регуляцию синтеза ФСГ.

Наши исследования были посвящены изучению роли мутации 769G->A гена INHα1 и количества СGG-копий гена FMR1 в регуляции физиологического резерва яичников. Для анализа мутации 769G->A гена INHa1 мы разработали метод, основанный на рестрикционном анализе продукта полимеразной цепной реакции (ПЦР) 2-го экзона с использованием эндонуклеазы рестрикции BstV1I. В случае мутации на одной из хромосом 2 исчезает один из сайтов узнавания BstV1I, поэтому у гетерозигот на электрофореграмме наблюдаются рестрикционные фрагменты длиной 25, 85, 134 и 159 п.н.

При отсутствии мутации (дикий тип) после рестрикционного анализа мы наблюдали фрагменты 85, 25 и 134 п.н., в случае мутации 769G->A в гомозиготном состоянии – фрагменты длиной 85 и 159 п.н. (рис.1).

Мутация 769G->A в гене INHα1 выявлена у 4,4% женщин-доноров яйцеклеток (n = 183) и у 7,5% женщин с клиническим диагнозом ПИЯ (n = 53). Таким образом, данная мутация чаще отмечалась у индивидов с ПИЯ, чем в общей популяции женщин. У доноров яйцеклеток с данной мутацией количество ооцитов, полученных после стимуляции, было статистически достоверно меньше (5,0 ± 1,3), чем у доноров без мутации (10,9 ± 2,8).

Для идентификации количества СGG-повторов в гене FMR1 Cy-5 меченые продукты ПЦР анализировали на автоматическом лазерном флуориметре ALF-express (рис. 2).

В результате проведенного исследования среди 477 женщин-доноров яйцеклеток выявлено 4,8% носителей аллелей высокого риска (≥ 40 СGG-повторов), у доноров с аллелями высокого риска или премутацией на втором цикле стимуляции овуляции необходимая доза гонадотропина была существенно выше, чем у доноров без премутации.

Данные, полученные нами в группе доноров яйцеклеток, которым проводили стимуляцию овуляции с использованием гонадотропина, а также у пациенток с ПИЯ, – новое доказательство вовлечения генов FMR1 и INHα1 в регуляцию функционального резерва яичников. Эти данные – также веский довод в пользу проведения тестирования мутаций генов INHα1 и FMR1 у молодых женщин с целью раннего выявления риска развития ПИЯ и планирования рождения ребенка. Программа генетического тестирования важна для выбора стратегии стимуляции овуляции у пациенток с бесплодием, которые проходят лечение методом экстракорпорального оплодотворения, а также для доноров яйцеклеток.


Литература

1. McKinlay S.M., Brambilla D.J., Posner J.G. The normal menopause transition. Maturitas 1992; 14: 103-15.

2. Epplen J.T., Buitkamp J., Bocker T., Epplen C. Indirect gene diagnoses for complex (multifactorial) diseases a review. Gene 1995; 159: 49-55.

3. Wollett H. Questioning «mother hoad» as a model for womens lives and development. Paper presented at Womtn and psychology Conference, University of Leeds 1995.

4. Jones G.S., de Morales-Ruehsen M. A new syndrome of amenorrhea in association with hypogonadotropism and apparently normal follicular apharatus. Am J Obstet Gynecol 1969; 104: 597.

5. Laml T., Schulz-Lobmeyr L.A. Obruca Premature ovarian failure: etiology and prospects. Gynecol Endocrinol 2000; 14; 292-302.

6. O’Herlity C., Pepperell R.J., Evans J.H. The significance of FSH Elevations in young women with disorders of ovulation. Brit Med J 1980; 281: 1447-50.

7. Andrew N. Shelling, Karen A. Burton, Ashwini L. Chand, Cynhia C.van Ee, John T. France et al. Inhibin: a candidate gene for premature ovarian failure // Hum Reprod. – 2000. – V.15. – № 12. – P. 2644-2649.

8. Vermeulen A. Environment, human reproduction, menopause and andropause. Environment Health Perspectives Supplements 1993; 101 (suppl 2): 91-100.

9. Cramer D.W., Xu H.J., Harlow B.L. Family history as a predictor of early menopause // Fertil Steril. – 1995. – V. 64. – № 4. –P. 740-745.

10. Fitch N., de Saint Victor J., Richer C.L., Pinsky L., Sitahal S. Premature menopause due to a small deletion in the long arm of the X chromosome: a report of three cases and a review // Am J Obstet Gynecol. – 1982. – V. 142. – № 8. – P. 968-972.

11. Coulam C.B. The prevalence of autoimmune disorders among patients with primary ovarian failure // Am J Repro Immunol. – 1983. – V. 4. – № 2. – P. 63-66.

12. Mattison D.R., Evans M.I., Schwimmer W.B., White B.J., Jensen B., Schulman J.D. Familial premature ovarian failure // Am J Hum Gen. – 1984. – V. 36. – № 6. – Р. 1341-1348.

13. Vegetti W., Tibiletti M.G., Testa G. et al. Inheritance in idiopathic ovarian failure – analysis of 71 Cases // Hum Repro. – 1998. – V. 13. – № 7. – Р. 1796-1800.

14. Van Kasteren Y.M., Hundscheid R.D.L., Smits A.P.T., Cremers F.P.M., van Zonneveld P., Braat D.D.M. Familial idiopathic premature ovarian failure: an overrated and underestimated genetic disease? // Hum Repro. – 1999. – V. 14. – № 10. – P. 2455-2459.

15. McKusick V.A., Francomano C.A., Antonarakis S.E., Pearson P.L. Mendelian Inheritance in man: A catalogs of human genes and genetic disorders. – 11th ed. – Baltimore: The Johns Hopkins University Press. – 1994. – V. 2. – P. 3009

16. Webb T.P., Bundey S.E., Thake A.I., Todd J. Population incidence and segregation rations in the Martin-Bell syndrome // Am J Med Genet. – 1986. – V. 23. – № 2. – P. 573-580.

17. Fu Y.H., Kuhl D.P., Pizzuti A., Pieretti M., Sutcliffe J.S., Richards S., Verkerk A.J., Holden J.J., Fenwick R.G., Jr, Warren S.T. et al. Variation of the CGG-repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox // Cell. – 1991. – V. 67. – № 6. – Р. 1047-1058.

18. Oberle I., Rousseau F., Heitz D., Kretz C., Devys D., Hanauer A., Boue J., Bertheas M.F. and Mandel J.L. Instability of a 550-base pair D.N.A segment and abnormal methylation in fragile X syndrome // Science. – 1991. – V. 252. – № 5010. – Р. 1097-1102.

19. Verkerk A.J., Pieretti M., Sutcliffe J.S., Fu Y.H., Kuhl D.P., Pizzuti A., Reiner O., Richards S., Victoria M.F., Zhang F.P. et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome // Cell. – 1991. – V. 65. – № 5. – Р. 905-914.

20. Sutcliffe J.S., Nelson D.L., Zhang F., Pieretti M., Caskey C.T., Saxe D. and Warren S.T. DNA methylation represses FMR-1 transcription in fragile X syndrome // Hum Mol Genet. – 1992. – V. 1. – № 6. – Р. 397-400.

21. Pieretti M., Zhang F.P., Fu Y.H., Warren S.T., Oostra B.A., Caskey C.T. and Nelson D.L. Absence of expression of the FMR-1 gene in fragile X syndrome // Cell. – 1991. – V. 66. – № 4. – Р. 817-822.

22. Devys D., Lutz Y., Rouyer N. et al. The FMR1 protein is cytoplasmic, most abudant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X permutation // Nat Genet. – 1993. – V. 4. – № 4. – P. 335-340.

23. Murray A., Ennis S., MacSwiney F., Webb J. and Morton N.E. Reproductive and menstrual history of females with fragile X expansions // Eur J Hum Genet. – 2000. – V. 8. – № 4. – P. 247-252.

24. Murray A., Webb J., MacSwiney F., Shipley E.L., Morton N.E. and Conway G.S. Serum concentrations of follicle stimulating hormone may predict premature ovarian failure in FRAXA premutation women // Hum Reprod. – 1999. – V. 14. – № 5. – Р. 1217-1218.

25. Sherman S.L. Premature ovarian failure in the fragile X syndrome // Am J Med Genet. – 2000. – V. 97. – № 3. – Р. 189-194.

26. Mallolas J., Duran M., Sanchez A., Jimenez D., Castellvi-Bel S., Rife M. and Mila M. Implications of the FMR1 gene in menopause: study of 147 Spanish women // Menopause. – 2001. – V. 8. – № 2. – Р. 106-110.

27. Sullivan A.K., M-Marcus, Epstein M.P., Allen E.G., Anido A.E., Paquin J.J., Yadav-Shah M. and Sherman S.L. Association of FMR1 repeat size with ovarian dysfunction // Hum Reprod. – 2005. – V. 20. – № 2. – P. 402-412.

28. Ling N., Ting S.Y., Ueno N., Esch F., Denoroy L. and Guillemin R. Isolation and partial characterization of a Mr 32,000 protein with inhibin activity from porcine follicular fluid // Proc Natl Acad Sci USA. – 1982. – V. 82. – № 21. – P. 7217-7221.

29. Miyamoto K., Hasegawa Y., Fukuda M., Nomura M., Igarashi M., Kangawa K. and Matsuo H. Isolation of porcine follicular fluid inhibin of 32K daltons. Biochem Biophys Res Commun. – 1985. – V. 129. – № 2. – P. 396-403.

30. Rivier J., Spiess J., McClintock R., Vaughan J. and Vale W. Purification and partial characterization of inhibin from porcine follicular fluid // Biochem Biophys Res Commun. – 1985. – V. 133. – № 1. – P. 120-127.

31. Robertson D.M., Foulds L.M., Leversha L., Morgan F.J., Heam M.T., Burger H.G., Wettenhall R.E. and de Kretser D.M. Isolation of inhibin from bovine follicular fluid // Biochem Biophys Res Commun. – 1985. – V. 126. – № 1. – P. 220-226.

32. Ling N., Ying S.Y., Ueno N., Shimasaki S., Esch F., Hotta M. and Guillemin R. A homodimer of the beta-subunits of inhibin A stimulates the secretion of pituitary follicle stimulating hormone // Biochem Biophys Res Commun. – 1986. – V. 138. – № 3. – P. 1129-1137.

33. Vale W., Rivier J., Vaughan J., McClintock R., Corrigan A., Woo W., Karr D. and Spiess J. Purification and characterization of an FSH releasing protein from porcine ovarian follicular fluid // Nature. – 1986. – V. 321. – № 6072. – P. 776-779.

34. Santoro N., Adel T. and Skurnick J.H. Decreased inhibin tone and increased activin A secretion characterize reproductive aging in women // Fertil Steril. – 1999. – V. 71. – № 4. – P. 658-662.

35. Burger H.G., Cahir N., Robertson D.M. el al. Serum inhibins A and B fall differentially as FSH rises in perimenopausal women // Clin Endocrinol. – 1998. – V. 48. – № 6. – P. 809-813.

36. Shelling A.N., Burton K.A., Chang A.L., van. Eecc., France J.T. et al. Inhibin: a candidate gene prematuture ovarian failure // Hum Reprod. – 2000. – V. 15 – № 12 – Р. 2644-2649.