Репродуктология: от науки к практике.Как определить наилучший вариант лечения?

В апреле этого года в Киеве прошел Международный симпозиум по вопросам репродуктивной медицины «От науки к практике», организаторами которого выступили Министерство здравоохранения Украины, Буковинский государственный медицинский университет и Украинская ассоциация репродуктивной медицины (УАРМ).

Научный симпозиум «Как определить наилучший вариант лечения?» компании «Мерк Сероно» открыл вице-президент УАРМ В.Д. Зукин. Он обратился ко всем присутствующим с приветственным словом и отметил, что у отечественных специалистов есть прекрасная возможность ознакомиться с новейшими научными тенденциями и практическим опытом ведущих зарубежных ученых в области репродуктологии.

Профессор Рене Фридман, советник министра науки и здравоохранения Франции, руководитель отделения гинекологии, акушерства и репродуктивной медицины больницы Антуана Беклера выступил с докладом «Что мы знаем о фолликулогенезе?».

Как известно, фолликулогенезом называется этапное развитие фолликулов от примордиальных через стадии первичных и вторичных до третичных (преовуляторных) фолликулов, или граафовых пузырьков. Фолликулогенез возникает в период полового созревания и продолжается до наступления менопаузы.

В организме человека этот процесс начинается с того момента, когда несколько фолликулов выходят из резервного пула (инициация), а его кульминацией является формирование одного доминантного фолликула в каждом менструальном цикле (МЦ).

Фолликулогенез включает 4 фазы (рис. 1):

1. Инициацию.

2. Ранний рост фолликулов.

3. Селекцию из доступного пула фолликулов.

4. Созревание преовуляторного фолликула.

Для того чтобы новые растущие фолликулы достигли преантральной стадии (0,15 мм), требуется несколько месяцев. Еще через 70 дней преовуляторный фолликул достигает размера 2 мм.

Следует учитывать, что до момента, когда возникает потребность вмешательства в процессы фолликулогенеза (стимуляция яичников), проходит несколько месяцев. И до этого момента развивающиеся фолликулы имеют «свою историю».

Процессы инициации и раннего роста фолликулов

Ранний рост фолликула регулируется тонким взаимодействием между фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) и местными факторами, продуцируемыми клетками теки, гранулезной оболочки и ооцитом. На данный момент это является новейшим открытием. Щелевидные соединения (GAP junctions) между ооцитом и клетками гранулезы, которые образуются посредством двух коннексинов (Сх43 и Сх47), имеют фундаментальное значение в период базального фолликулярного роста. Если эти два соединения не экспрессируются в ооцитах, рост фолликулов замедляется и даже останавливается. Кроме влияния ооцита на клетки гранулезы и в меньшей степени теки, наблюдается и обратный процесс, а именно влияние факторов гранулезы на ооцит. Одним из таких факторов, ответственным за формирование примордиальных фолликулов и взаимодействие ооцита и клеток гранулезы, является так называемый kit-ligand (KL) – фактор роста стволовых клеток. Конечно же, немаловажным является наличие определенных рецепторов и антимюллерова гормона (АМГ). В последние годы также определена роль ооцита в процессах активации фолликулогенеза. Механизмы, которые отвечают за выход фолликулов из состояния покоя и определяют начало их роста и дифференцировки в фазе инициации, осуществляются посредством двух факторов ооцитов, таких как фактор роста и дифференцировки 9 (Growth differenciation factor, GDF-9) и морфогенетический протеин кости (Bone morphogenetic protein, ВMP 15). Так, мыши, мутантные по CDF-9 -/-, страдают гипергонадотропным гипогонадизмом. У гомозиготных овец с инактивированным ВMP 15 наблюдается бесплодие. При наличии врожденного блефарофимоза в сочетании с бесплодием была доказана недостаточность ВMP 15.

Тонкий механизм взаимодействия ооцита и окружающих клеток гранулезы в процессе фолликулогенеза был недавно описан. Прегранулезные клетки выделяют KL и фактор, ингибирующий лейкемию (Leukemia inhibitory factor, LIF), которые способствуют фолликулярному развитию ооцита. У человека ингибиция рецептора KL приводит к атрезии фолликула.

Кроме того, на сегодняшний день имеется достаточное количество данных о роли АМГ в процессе фолликулогенеза. Исследования in vitro показали, что АМГ блокирует выход примордиальных фолликулов из состояния покоя и является антагонистом факторов, стимулирующих этот процесс (KL и BMP 15). К ингибирующим факторам также относят транскрипционный фактор Foxo 3 и регуляторный белок фосфатидилинозитол-3-киназа (PTEN). При недостаточности/отсутствии вышеперечисленных субстанций у мышей развивается преждевременная недостаточность яичников. На начальной фазе фолликулогенеза в качестве ингибитора могут выступать также и андрогены.

Часто репродуктологи задаются вопросом: почему у молодых женщин, имеющих множество фолликулов, их созревание происходит по-разному? Суть в том, что существует определенный баланс между активирующими и деактивирующими этот процесс факторами. Иногда преобладают процессы торможения. Важнейшее значение имеет биосинтез эстрадиола из андрогенов в яичниках. В некоторых клинических случаях, для того чтобы улучшить изначально неудовлетворительную реакцию яичника на стимуляцию, в течение определенного периода времени можно использовать именно андрогены. Существует мнение, что на преантральной стадии развития фолликула процессы фолликулогенеза не зависят от влияния гонадотропинов. В то же время учеными доказано присутствие рецепторов лютеинизирующего гормона (ЛГ) и ФСГ уже на стадии преантрального фолликула, что ставит под сомнение предыдущее утверждение.

Известно, что при введении ФСГ в конце фолликулиновой фазы реакция яичников будет улучшаться, а в ходе развития фолликулов не возникнет атрезии ооцитов. В течение МЦ (особенно в ранней фолликулиновой фазе) вышедшие из состояния покоя фолликулы растут очень быстро, при этом в фолликулярной жидкости уже присутствует эстрадиол. Именно это предопределяет реакцию яичников на стимулирование при помощи ФСГ. В то же время синтез данного гормона на этот момент находится на низком уровне. В середине фолликулиновой фазы влияние эстрогена достаточно выражено, что обусловлено выработкой прогестерона под действием ЛГ. Синтез всех этих необходимых веществ в организме человека на данном этапе является крайне интересным и важным для анализа процессом.

Селекция фолликула

При отборе фолликулов руководствуются следующими критериями:

• диаметр фолликула равен 5-8 мм;
• быстрый рост фолликулов под влиянием ФСГ;
• наличие ароматазы P₄₅₀ (участвует в процессах преобразования гормонов) в гранулезных клетках.

Также важнейшая роль в процессе селекции фолликула отводится инсулиноподобному фактору роста (Insulin-like growth factor, IGF).

У всех млекопитающих фолликулы выходят из состояния покоя и входят в фазу роста, созревания и селекции доминантного фолликула. Момент прекращения функционирования яичников генетически детерминирован и зависит от величины первоначального овариального резерва и от скорости атрезии фолликулов, которая регулируется соотношением про- и антиапоптотических факторов. При этом вследствие апоптоза основная масса фолликулов редуцируется путем атрезии, происходящей на всех стадиях их развития. Известно, что отсутствие такого проапоптического фактора как Bax protein повышает фертильность и уменьшает связанные с возрастом негативные изменения в организме мышей-самок. Применение сфингозина 1-фосфата обеспечивает сохранение фертильности у облученных мышей.

С возрастом у женщины наблюдается преобладание процессов апоптоза и соответственно снижение овариального резерва. При этом неизвестно, в какой именно момент начнет снижаться фертильность и когда она исчезнет вообще.

Актуальной является информация о двух исследованиях, результаты которых, наверное, могут изменить будущее. Группа исследователей во главе с J.L. Tilly (2004, 2006, 2009) уже не первый год детально изучает процессы фолликулогеназа. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что количество фолликулов не ограничено только теми, которые имеются у девочек при рождении. Ученые считают, что процессы обновления в яичниках происходят даже в подростковом возрасте. Так, было установлено, что в яичниках мышей молодого и репродуктивного возраста содержатся большие овоидные клетки, напоминающие фетальные герминогенные клетки, располагающиеся в поверхностном эпителиальном слое. Эти весомые данные свидетельствуют в пользу пролиферации герминогенных клеток и образования фолликулов в яичниках мышей и в постнатальном периоде. В следующем исследовании этой же группы авторов было доказано, что яичники взрослых самок мышей способны производить сотни ооцитов, несмотря на небольшой пул премейотических герминальных клеток. Авторы считают, что стволовые клетки красного костного мозга могут мигрировать в яичник и участвовать в постнатальном оогенезе. В выводах ученых высказано предположение, что полученные данные, возможно, в корне изменят наше представление о фолликулярном резерве, и в будущем появится реальная возможность отсрочить время наступления менопаузы и/или преждевременного истощения яичников.

В марте этого года вышла публикация, в которой представлены результаты нового успешного эксперимента группы ученых под руководством профессора J.L. Tilly. В ходе исследования в лабораторных условиях из стволовых клеток, взятых из яичника молодой женщины, были выращены яйцеклетки. Авторы выделили стволовые клетки яичников благодаря специфическому белку DDX4, покрывающему их поверхность. Затем в течение двух недель in vitro из стволовых клеток развились ооциты, после чего незрелые яйцеклетки были пересажены в кортикальную оболочку яичника человека и вживлены под кожу живой мыши. Там ооциты созрели и превратились в зрелые яйцеклетки, которые, как утверждают исследователи, по своим функциональным характеристикам ничем не отличаются от производимых в женском организме естественным путем. Таким образом, было доказано, что в яичнике взрослой женщины присутствуют стволовые клетки, из которых могут вырабатываться ооциты in vitro.

Имеются также результаты исследования A.J. Hsueh et. аl. (2010), которые у специалистов вызывают много вопросов. В них указано, что дозревание яйцеклеток можно обеспечить путем активации дремлющих фолликулов. Это означает, что если «отключить» ингибицию спящих фолликулов, начнется их активация и рост. Если стимулируя неактивные фолликулы, удастся «дойти» до стадии созревания, это станет важнейшим этапом и научным направлением в будущем. Откроются новые репродуктивные перспективы для женщин в возрасте и тех, у кого наблюдается плохая реакция на стимуляцию яичников. Краткосрочная активация «спящих» фолликулов в условиях in vitro позволяет активировать стволовые клетки, что способствует преодолению бесплодия у женщин. Также данное открытие, безусловно, найдет свое применение у пациенток с онкопатологией и желающих пройти процедуру криоконсервации яичников.

В конце своего выступления профессор отметил, что несмотря на имеющиеся научные достижения фолликулогенез до сих пор остается для ученых не до конца изученной тайной, однако в свете последних открытий появляются удивительные и многообещающие перспективы.

Доклад «Индивидуализация протоколов стимуляции» представил профессор Карло Альвиги, Центр по лечению бесплодия Неаполитанского университета им. Фридриха II, Италия.

В начале выступления докладчик поблагодарил компанию «Мерк Сероно» за представившуюся возможность выступить перед украинскими коллегами, при этом отметив, что в докладе будут рассмотрены существующие на сегодняшний день подходы к индивидуализации протоколов овариальной стимуляции (ОС).

Выбор конкретного протокола проводится с учетом следующих факторов: демографических, антропометрических (возраст, индекс массы тела [ИМТ], расовая принадлежность), базального уровня гормонов (ФСГ, ЛГ, эстрадиол), уровня физического здоровья, длительности бесплодия, характера питания, данных о ранее проведенных циклах ЭКО. Работая в этой сфере более 20 лет, автор доклада пришел к выводу, что подбор протокола ОС является в основном эмпирическим. Пациенткам с подобными характеристиками назначают одинаковый (один из трех) базовый протокол. При этом в основном учитываются только вышеперечисленные факторы. Когда же речь идет об индивидуализации протокола, то необходимо учесть следующее. Сохранение достигнутого уровня наступления беременности или повышение этого показателя сегодня должно сопровождаться оптимальным показателем стоимость/эффективность. Также следует особое внимание уделить побочным эффектам, в т.ч. многоплодной беременности и риску развития синдрома гиперстимуляции яичников (СГСЯ), частоту которых мы стремимся снизить. Кроме того, существует такая проблема, как неадекватная реакция яичников на ОС, которую также необходимо решать с учетом показателя стоимость/эффективность. Все вышеперечисленное, на наш взгляд, и обусловливает необходимость индивидуализации протоколов ОС.

В последние годы для выполнения этой задачи проводилось множество исследований, возникли различные направления, о которых хотелось бы рассказать. Так, в настоящее время репродуктологи осведомлены о существовании достаточно нового поколения маркеров, таких как АМГ, подсчет антральных фолликулов (ПАФ), полиморфизм гонадотропинов, АМГ и их рецепторов. Исходя из этого, предпринимаются попытки разделения пациенток на отдельные группы.

Необходимо напомнить о том, что некоторые биомаркеры, включая АМГ, изначально использовались для определения вероятности наступления беременности у конкретной женщины или хорошей ответной реакции яичников на стимуляцию. В последние годы АМГ рассматривался в качестве одного из критериев при принятии решения о тактике ведения пациентки. Возникает вопрос: можно ли подобрать оптимальный протокол ОС, руководствуясь уровнем АМГ?

Именно такой подход использовали Nelson et al. (2009) в исследовании, проводившемся в двух репродуктивных центрах Италии (рис. 2). Ученые провели стратификацию пациенток по уровню АМГ на три группы: с нормальным, очень низким и высоким уровнем этого гормона. В первом центре всем женщинам независимо от уровня АМГ проводили стимуляцию яичников на основе стандартного протокола с использованием рекомбинантного ФСГ. Во втором центре у пациенток с нормальным уровнем АМГ использовали стандартный длинный протокол с агонистами гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ), а лицам с низким и высоким уровнем АМГ назначали антагонисты ГнРГ.

Анализируя полученные результаты, ученые пришли к выводу, что возможно у пациенток с нормальным уровнем АМГ оптимальным в плане стоимость/эффективность является стандартный длительный протокол с малой или средней дозой ФСГ. Для женщин с низким или высоким значением АМГ наилучшим вариантом будет использование антагонистов ГнРГ в комбинации с ФСГ в низкой или средней дозе. Если лицам со сниженным овариальным резервом назначать ФСГ в низких дозах, то в комбинации с антагонистами ГнРГ существенно снизится частота прерывания протокола вследствие развития СГСЯ. Следует учесть, что с повышением дозы ФСГ не всегда улучшается результат. При назначении женщинам с высоким уровнем АМГ антагонистов ГнРГ в комбинации с ФСГ в относительно низкой дозе (125-150 МЕ) отмечено достоверное снижение уровня госпитализаций вследствие развития СГСЯ. Таким образом, данное исследование впервые показало, что уровень АМГ может быть использован в качестве одного из критериев для выбора протокола стимуляции, а не только для оценки прогноза.

Еще одним примером такого подхода, но уже с использованием другого биомаркера, является показатель ПАФ. Вначале ПАФ проводили для прогнозирования ответной реакции яичника на стимуляцию и для определения вероятности наступления беременности. ПАФ использовали в комплексе с такими показателями, как ФСГ, возраст матери, ИМТ (алгоритм CONsistency in r-FSH Starting dOses for individualized tReatmenT, CONSORT). Далее рассчитывали начальную дозу ФСГ (Olivennes F. et al., 2008). Авторы этого исследования пришли к следующему выводу. Если подбирать начальную дозу ФСГ, исходя из вышеперечисленных параметров, то можно ожидать хороших результатов (повышение частоты наступления беременности) при назначении ФСГ в более низких дозах, нежели предполагалось ранее. В этом контексте показатель ПАФ выступает как функциональный маркер резерва яичника и используется для того, чтобы определить начальную дозу ФСГ. Таким образом, результаты этих двух исследований свидетельствуют о том, что при применении этих двух биомаркеров (АМГ и ПАФ) можно индивидуализировать протоколы ОС касательно улучшения показателя стоимость/эффективность.

Обобщая вышеизложенное, отдельное внимание следует уделить особенностям фармакогеномного подхода. В течение последних лет было выдвинуто предположение о том, что некоторые генетические заболевания пациенток могут предопределять ответную реакцию яичника на введение экзогенного гонадотропина. Для подтверждения или отрицания данного предположения были проанализированы некоторые генетические маркеры (ген рецептора ФСГ (FSHR), АМГ и рецептора АМГ (AMH – AMHR2), метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), рецепторов эстрогенов (ER1, ER2), вариантного ЛГ (V-LH)) в контексте ответной реакции яичника на введение гонадотропинов.

Может ли определенный полиморфизм генов предопределять реакцию яичника на введение экзогенного гонадотропина? Хотелось бы подробнее остановиться на исследовании De Рlacidо et al. (2001), в котором изучали гипореактивность яичника на введение рекомбинантного ФСГ молодым женщинам с нормальным уровнем гонадотропинов. Однако при этом нужно четко понимать, что означает термин «недостаточная ответная реакция». Раньше в клинической практике при проведении контролированной ОС реакция считалась недостаточной или плохой, если количество полученных ооцитов было меньше 3-5 независимо от использованной дозы ФСГ. При этом в течение последних лет мы выделили конкретную группу пациенток с гипореактивностью яичника при введении ФСГ. На наш взгляд, это понятие отличное от так называемой плохой реакции. Как правило, пациентки с недостаточной реакцией яичника – молодые женщины с нормальным овариальным резервом и уровнем эндогенных гонадотропинов, АМГ и ПАФ. Однако при проведении стимуляции им требуется более высокая доза гонадотропина или более длительный протокол ОС, нежели предполагалось ранее. Потому мы считаем, что у них имеет место гипосенситивность к ФСГ, т.е. устойчивость яичника к воздействию экзогенного гонадотропина. Поэтому эти пациентки нуждаются в ином подходе. Прежде считалось, что у них просто имеет место замедленная реакция. Однако все зависит от характеристик фолликулов. В этой ситуации в начале стимуляции наблюдается замедленный рост фолликулов, а уровень эстрадиола не повышается, как ожидалось. Это вынуждает повышать начальную дозу ФСГ в ходе стимуляции. Например, если начинать с дозы ФСГ 150 МЕ у молодой женщины с нормальными показателями, то вероятно через 10-11 сут суммарная доза составит 1500 МЕ ФСГ. Однако иногда приходится повышать дозу и продлевать стимуляцию. В итоге для достижения результата пациентка получает ФСГ в дозе более 2000, а иногда 3000 МЕ.

Для объяснения подобного феномена были выдвинуты гипотезы о низком уровне (активности) эндогенного ЛГ и неадекватного ответа на введение ФСГ. Более детальный анализ показал, что если реакция яичника в ходе стимуляции понижена, то при дополнительном назначении ЛГ, как бы «в нагрузку», у многих из этих пациенток улучшается рост фолликулов (их количество не увеличивается). Поэтому добавление ЛГ в ходе стимуляции оказывает лучший эффект, нежели просто повышение дозы ФСГ. Все это позволяет сделать вывод о том, что у таких пациенток может быть недостаточным уровень собственного биоактивного ЛГ при том, что все базовые показатели гонадотропинов находятся в норме. Данный феномен можно объяснить следующим образом: у таких пациенток уровень собственного биоактивного ЛГ снижен, но на течении спонтанного (физиологического) МЦ это особым образом не сказывается. Однако в стрессовой ситуации (ОС), когда происходит рост множества фолликулов, собственного биоактивного ЛГ оказывается недостаточно.

Сегодня доказано существование менее биологически активного варианта ЛГ – VbЛГ, который с высокой вероятностью ассоциируется со слабым ответом яичника на ФСГ в процессе стимуляции. Это обусловливает назначение ФСГ в более высоких дозах и более длительных протоколов стимуляции. В Италии распространенность такого полиморфизма составляет 13-14%, на севере Европы – до 30%. Состояние гетерозиготы по этому варианту связано с необходимостью повышения дозы ФСГ в протоколе ОС. Пациенткам, гомозиготным по этому варианту, требуются самые высокие дозы ФСГ. Таким образом, если заранее известно о наличии данного полиморфизма, следует начинать стимуляцию с изначально высокой дозы ФСГ и дополнять схему протокола введением ЛГ.

Существует еще одна ситуация, когда при проведении ОС требуется повышенная доза ФСГ. Это обусловлено полиморфизмом генов рецепторов ФСГ (генотип FSH-R: Ser⁶⁸⁰). Необходимо отметить, что данная мутация присутствует у 25% пациенток. В результате исследования было доказано, что такие женщины нуждаются в более высокой дозе ФСГ в ходе стимуляции (точно так же, как и при наличии VbЛГ).

В исследованиях P. Mayorga (2000), Sudo et al. (2002), Choi et al. (2004), Falconer et al. (2005) было продемонстрировано следующее. У пациенток с полиморфизмом генов рецепторов ФСГ показатель ПАФ чаще всего повышен. Выходит, что ориентируясь на данные ПАФ и не зная о наличии гипосенситивности к ФСГ (генотип FSH-R: Ser⁶⁸⁰), у каждой четвертой пациентки мы начинаем ОС с более низкой дозы ФСГ, а впоследствии вынуждены ее повышать, что чревато развитием СГСЯ. Если же предварительно обследовав женщину на наличие FSH-R: Ser680, мы проводим ОС с изначально более высокой дозой ФСГ (что более подходит в данном случае), то тем самым избежим риска развития СГСЯ. Таким образом, необходимо объединить всю имеющуюся информацию о пациентке, а именно: показатель ПАФ и уровень АМГ плюс дополнительно по возможности учитывать ее генетические характеристики. Это поможет скорректировать стартовую дозу или весь протокол ОС, исходя из общего набора данных.

Следует обратить внимание еще на один аспект. Относительно индивидуализации протоколов ОС необходимо обязательно упомянуть о так называемой мягкой стимуляции.

В одном из центров репродуктологии на севере Италии Esther M. et al. (2007) провели следующее исследование, разделив пациенток на две группы. Участницам первой группы проводили стимуляцию яичников, используя стандартный протокол с рекомбинантным ФСГ в дозе 150 МЕ; в каждом цикле было перенесено по 2 эмбриона. Женщинам второй группы назначали ФСГ в той же дозе (150 МЕ) с переносом одного эмбриона. Им проводили мягкую стимуляцию, поскольку в отличие от пациенток первой группы назначали ФСГ на 5-е, а не на 1-е или 2-е сутки. Основная идея мягкой симуляции состоит в том, что необходимо подождать, пока в яичнике отбор фолликулов произойдет естественным образом, и уже потом стимулировать их. Следовательно, в рост идут лучшие фолликулы. Через год таких наблюдений было доказано, что частота наступления беременности у женщин в обеих группах не различалась. Заслуживает внимания также и то, что при мягком стимулировании число многоплодных беременностей намного снизилось, а вес детей при рождении был больше. В дополнение выяснилось, что при мягком стимулировании частота развития СГСЯ была ниже, чем при стандартном протоколе.

Вместе с тем данная методика имеет определенные недостатки. Пациентки, которым проводят мягкое стимулирование, суммарно проходят большее количество циклов стимуляции в год. Это просто иной подход, а главное состоит в том, чтобы сделать правильный выбор: получить большее количество ооцитов за один цикл стимуляции или провести больше циклов самой стимуляции. Что же лучше? По данным исследователей, проведение ОС сопровождалось определенным дискомфортом, без существенных различий по группам сравнения. Что же касается экономии, то уровень затрат при применении стандартных протоколов стимуляции ниже в сравнении с циклами мягкой стимуляции, поскольку последние нужно повторять большее число раз. Однако при сравнении расходов в пери- и неонатальный периоды ситуация оказалась в пользу мягкой стимуляции.

Между тем остается вопрос: всем ли можно проводить мягкую стимуляцию? По нашему мнению, такой вариант стимуляции подходит для женщин с нормальным показателем ПАФ, уровнем АМГ и др. Кроме того, существуют социальные, культурные, экономические и законодательные аспекты этого вопроса. Например, у пациентки есть необходимость многократного повтора цикла, и государство оплачивает 1, 2, максимум 3 цикла, дальше она платит сама. При таких условиях вряд ли можно предлагать мягкую стимуляцию. Необходимо использовать эти несколько оплаченных циклов так, чтобы получить большее количество ооцитов и, соответственно, эмбрионов. Даже с точки зрения психологии следует понимать, каким именно пациенткам подходит мягкая стимуляция. Вначале вроде все пациентки соглашаются повторить попытку 3-4 раза, несмотря на то что по каждому циклу вероятность беременности весьма невысока. Однако, как показывает практика, если после первого цикла результат является отрицательным, женщина просто покидает программу ВРТ, считая, что репродуктологи ей не смогли помочь. В такой ситуации многие пациентки выбывают из программы. Именно поэтому мягкая стимуляция – это вариант, хотя он подходит лишь определенной категории лиц.

Далее симпозиум продолжил основатель и директор компании Reprogenetics Сантьяго Мунне докладом на тему «Геномика при селекции эмбрионов».

В начале своего выступления докладчик отметил, что большинство эмбрионов, получаемые в условиях in vitro, имеют хромосомные отклонения. Даже у морфологически неизмененных эмбрионов у более половины случаев (56%) обнаруживают хромосомные аномалии (рис. 3).

В ходе недавно проведенного исследования эмбриологи дважды с определенным временным промежутком проводили эмбриоскопическое исследование, и согласно морфологическим критериям, выбирали наилучшие эмбрионы. Последующее выполнение сравнительной геномной гибридизации (array-Comparative Genomic Hybridization, aCGH) для оценки этих эмбрионов показало, что 60% бластоцист имели хромосомные аномалии. Через некоторое время при повторном проведении aCGH половина отобранных при эмбриоскопии бластоцист были анеуплоидными.

Чтобы наглядно показать значение предимплантационной генетической диагностики (ПГД) хромосомных отклонений для ЭКО, следует проанализировать данные Общества вспомогательных репродуктивных технологий (Society for assisted reproductive technologies, SART) за 2008 г. (табл. 1). Как видно из анализа, уровень имплантации у молодых пациенток до 35 лет составляет 32%, а у женщин 41-42 лет – всего 6%. С возрастом матери изменяется и уровень хромосомных аномалий у эмбрионов. У женщин до 35 лет их частота составляет 54%, а в возрасте 41-42 лет достигает 82%.

В этом же исследовании были представлены следующие данные, на которые следует обратить внимание. Частота имплантационных потерь, не связанных с хромосомными аномалиями, у молодых женщин составила 14%, а у пациенток в возрасте 41-42 лет – 12%. Долгое время существовала следующая гипотеза: если в процессе ПГД исключить аномальные эмбрионы (≈50%), то уровень имплантации возрастет вдвое (Munne S. et al., 1993). В реальности же использование метода флюоресцентной гибридизации in situ (Fluorescence in situ hybridization, FISH) c проведением биопсии эмбриона на 3-й день развития оказалось не таким эффективным, как предполагалось. Результаты выполнения FISH с биопсией эмбриона на 3-й день у разных исследователей показали различную эффективность и не оправдали ожиданий. Ряд авторов объяснял это мозаицизмом и самокоррекцией эмбрионов. По мнению докладчика, основная причина таких различий – чисто техническая, обусловленная методикой проведения биопсии. Явления мозаицизма и самокоррекции эмбрионов не имеют существенного влияния. Учитывая результаты множества проведенных исследований, можно сделать вывод, что чем большее количество хромосом подвергается анализу, тем понятнее становится, что у каждого эмбриона есть хромосомные отклонения. Было проведено сравнение эффективности выполнения FISH по 12 и 24 хромосомам. В исследовании на 24 образцах по сравнению с 12 было обнаружено на 50% больше аномалий. Однако аномальных эмбрионов при этом было идентифицировано только на 20% больше. Согласно статистике, на сегодняшний день частота ложных результатов при aCGH составляет 2%. Как отмечает докладчик, основная проблема, объясняющая неоправдавшиеся ожидания от ПГД, – это техника проведения эмбриональной биопсии. Частота ошибочных результатов при выполнении ПГД находится в прямой зависимости от конкретной лаборатории. Так, по данным Baart et al. (2004), уровень ошибок при проведении FISH достигал 50%, по данным Gleicher et al. (2009) – 15-20%. Согласно нашим данным (Munnе et al., 2002), уровень ошибочных результатов при проведении FISH-9 составляет 7,2%. Следует обратить внимание на то, что ложные результаты при выполнении ПГД методом aCGH были отмечены только в 1,8% случаев согласно результатам исследований Gutierrez-Mateo et al. (2011) и в 6% по данным Geraedts et al. (2011).

При проведении ПГД исследование можно проводить на трех разных стадиях развития: биопсия полярного тельца, биопсия бластомера и трофоэктодермальная биопсия бластоцисты. При выполнении биопсии полярных телец с целью ПГД не диагностируются 30% постмейотических хромосомных аномалий. Кроме того, приходится анализировать в 3 раза больше клеток, чем при биопсии бластоцисты. Это существенно увеличивает временные и финансовые затраты.

При биопсии бластомера на 3-тьи сутки потенциал имплантации эмбриона снижается на 30-60%. В этой ситуации получаемая от проведения ПГД польза не всегда оправданна. Безусловно, во многом конечный результат определяется квалификацией специалиста, выполняющего исследование.

Впервые положительные результаты применения биопсии бластоцисты при ПГД были получены в 2010 г. (Schoolcraft et al.). По мнению докладчика, переход на биопсию бластоцисты полностью раскрывает весь потенциал методики ПГД. В сравнении с биопсией бластоцисты выполнение биопсии эмбриона на 3-тьи сутки показывает худшие результаты. Так, исследования, проведенные Treff N.R. et al. (2011) по оценке имплантации в зависимости от проведения ПГД показали следующее. Уровень имплантации при биопсии эмбриона на 3-й день составил 31% в сравнении с 51% у эмбрионов, которым биопсия не проводилась. Частота имплантации эмбрионов, у которых данную процедуру выполняли на стадии бластоцисты, составила 52% и практически не отличалась от таковой у эмбрионов, которым исследование не проводили.

В США на сегодняшний день большинство центров переходит на биопсию бластоцисты с последующей диагностикой генетических нарушений методом aCGH. Преимущество этой методики состоит в скорости выполнения анализа, время проведения которого составляет менее 16 ч.

Сегодня имеются результаты проведения биопсии бластоцисты и переноса эмбриона на 6-е сутки. Данная методика продемонстрировала аналогичные или даже лучшие показатели в сравнении с классической. Как отмечает докладчик, постепенно проведение aCGH станет стандартом ПГД и в скором времени заменит некоторые процедуры пре- и постнатальной диагностики. Выполнение aCGH дает возможность определить анеуплоидию или транслокации всех 24-х хромосом менее чем за 16 ч, при этом не используется ДНК родителей.

В таблице 2 представлена частота хромосомных отклонений у эмбрионов в зависимости от их количества и возраста матери по результатам биопсии бластомера на 3-тьи сутки.

Чем больше полученных эмбрионов, тем выше вероятность того, что они будут более высокого качества. Следует учитывать, что с возрастом матери уровень эуплоидии существенно снижается. При выполнении биопсии на 5-е сутки отмечаются значительно лучшие результаты (табл. 3). Таким образом, если провести несколько циклов, то можно получить 100% нормальных эмбрионов. Согласно данным многих репродуктивных центров, при ПГД с биопсией бластоцисты на 5-е сутки уровень имплантации достигает 60%, а ранее составлял 35%. Таким образом, в определенной степени удается нивелировать влияние возраста матери на успешность имплантации.

ПГД также рекомендована при эмбриобанкинге, привычном невынашивании беременности, определении транслокаций. Кроме того, данный метод применяется для определения любых дефектов генов, хромосомных отклонений как у эмбриона, так и у будущих родителей на этапе преконцепционной подготовки.

По окончании выступлений участники симпозиума задавили докладчикам вопросы, касающиеся проблем, освещаемых в лекциях, интересовались мнением и тактикой ведущих иностранных специалистов при ведении пациенток с сопутствующей бесплодию патологией, активно дискутировали и обменивались собственным опытом.

Подготовила Мария Арефьева