Роль иммунологического фактора у женщин с неэффективными циклами IVF-ET в анамнезе

Имплантация эмбриона – сложный диалог между трофобластом и эндометрием с вовлечением многочисленных про- и противовоспалительных цитокинов, специфических молекул клеточной адгезии, эндокринных, паракринных и аутокринных механизмов. Одной из причин неэффективных циклов методики экстракорпорального оплодотворения с переносом эмбрионов (IVF-ET) при наличии эмбрионов хорошего качества является иммунологический фактор. Взаимодействие между матерью и эмбрионом развивается в противоположных направлениях: с одной стороны, эмбрион нуждается в надежной антиинфекционной защите, с другой – необходима иммунологическая толерантность матери к эмбриональным аллоантигенам [1].
Иммунология репродукции прошла длительный период развития. Так, в 1912 г. впервые оплодотворение стали рассматривать как реакцию антиген-антитело.
В 1953 г. Питер Брайан Медавар предложил расценивать эмбрион как получужеродный аллогенный трансплантат. Tom Wegmann и др. в 1993 г. выдвинули концепцию иммунотропизма, согласно которой беременность стали рассматривать как феномен Т-хелперов 2-го типа (Th2). На сегодняшний день общепринятой является концепция эволютивных взаимоотношений [2].
Для объяснения иммунологической загадки беременности выдвигалось большое количество гипотез, суть большинства которых сводилась к супрессии иммунного ответа во время беременности. Однако исследованиями последних лет доказано, что гестация является феноменом активации, а не супрессии (Сотникова Н.Ю., 2010). Активация иммунной системы во время беременности должна очень точно контролироваться, иначе может привести к развитию патологических состояний.
Основными иммунологическими факторами нарушения имплантации и гестации являются: наличие эмбриотоксических антител; дисбаланс цитокинов Th1 (фактора некроза опухоли α [TNF-α], γ-интерферона [IFN-γ], интерлейкинов [IL] – IL-2, IL-12, IL-18) и Th2 (IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13), а также дисбаланс экспрессии натуральных, или естественных, киллеров (NK-клетки). Механизмы, обеспечивающие процесс выживания эмбриона и плода: селективная экспрессия антигенов, критичных по аллореактивности; гормональная иммуносупрессия; наличие некоторых цитокинов и молекул клеточной адгезии в маточно-плодовом пространстве; индукция дифференцировки и накопления регуляторных Т-клеток; индукция апоптоза активированных клеток.
Фактор, ингибирующий лейкемию (LIF), – один из самых интересных с точки зрения репродуктивной функции цитокинов – впервые был идентифицирован в 1986 г. Metсalf и др. в Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research (Мельбурн, Австралия) [3]. Это высокогликолизированный полипептид с молекулярной массой 20 000 Да, который кодируется геном, локализованным у человека в хромосоме 22q12. Потенциальными индукторами синтеза LIF являются IL-1, TNF-α, эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста (TGF) [4].
Установлено, что LIF in vitro поддерживает эмбриональные стволовые клетки в недифференцированном состоянии, ингибируя их дифференциацию, но не влияет на пролиферацию клеток [5]. Таким образом, выяснилось, что LIF является первым протеином, способным влиять на фенотип эмбриональных клеток. Было также выявлено, что LIF и РНК продуцируются бластоцистой [6] и в желточном мешке эмбрионов.
Прямые доказательства того, что LIF является фактором, абсолютно необходимым для процесса имплантации у мышей, были получены в экспериментах с использованием генной инженерии. Обнаружено, что у самок мышей с инактивированным LIF-геном процесс фертилизации яйцеклеток не нарушен, однако последние оказались не способными к имплантации [7].
При пересадке бластоцист от указанных самок в матку интактным самкам имплантация происходила нормально, что свидетельствует о значении LIF материнского происхождения для успешного внедрения эмбриона в матку. Искусственное введение мышам с дефицитом LIF-гена рекомбинантного цитокина способствовало восстановлению процесса имплантации. LIF присутствует практически во всех клеточных структурах и тканях репродуктивной системы человека, включая яичники, маточные трубы, матку и плаценту. Функцию цитокина можно определить на самых различных этапах репродуктивных процессов, начиная с роста и развития гамет и заканчивая наступлением и прогрессированием беременности.
Наиболее интригующими оказались результаты исследования функции LIF в эндометрии человека, где этот цитокин продуцируется в течение всего менструального цикла (МЦ) [8]. Было выявлено, что уровень LIF низок в пролиферативной фазе, а повышается после овуляции и остается относительно высоким почти до конца МЦ, снижаясь с началом менструации до базального уровня. Эти данные явились первыми указаниями на вероятную роль цитокина в имплантации человека. При иммуногистохимическом окрашивании выявлено, что LIF вырабатывается в железистом и поверхностном эпителии эндометрия и в меньшей степени – в строме [9]. В то же время экспрессия LIF-специфических рецепторов ограничена поверхностным и железистым видами эпителия. Эти данные дают возможность предположить, что протеин LIF может оказывать прямое воздействие аутопаракринным механизмом на эпителий эндометрия (но не на строму) и таким образом модулировать уровень рецептивности матки. Группой исследователей изучена взаимосвязь между экспрессией LIF, его рецепторами и таким морфологическим маркером восприимчивости матки к имплантации бластоцисты, как эндометриальные пиноподии [10].
NK-клетки в периферической крови составляют
10-15%, под влиянием стероидных гормонов их уровень в крови значительно повышается. Несмотря на то, что основные события иммунологического диалога мать-эмбрион происходят в месте имплантации, изменения в периферической иммунной системе (крови) в какой-то степени отображают состояние эндометриального иммунитета.
В эндометрии в первую фазу МЦ лейкоциты составляют 10% от числа стромальных клеток, во вторую – 20%, на ранних сроках беременности – 30%. При этом 70% всех лейкоцитов эндометрия во время беременности являются NK-клетками (большими гранулярными лимфоцитами). Поскольку зрелые маточные NK-клетки (uNK-клетки) присутствуют в эндометрии до имплантации бластоцисты, принято считать, что они являются необходимым элементом в этом процессе [11]. Их задача – обеспечить иммуносупрессию в месте имплантации, рост и развитие трофобласта. На поверхности NK-клеток имеются антигены CD16 и CD56. Клетки с маркерами CD56+CD16+ (90%) являются более цитотоксичными, а клетки с маркерами CD56+CD16- (10%) – основным источником регуляторных цитокинов. При беременности уровень CD56+CD16+ значительно понижается под влиянием прогестерона. Снижение уровня прогестерона вызывает повышение цитолитической активности NK-клеток и отторжение плодного яйца. Дисбаланс экспрессии NK-клеток приводит к нарушению имплантации и бесплодию, привычному невынашиванию, задержке внутриутробного развития плода; является важным этиопатогенетическим фактором развития эндометриоидной болезни и преэклампсии.
Цель исследования заключалась в изучении особенностей системного и местного (эндометриального) иммунитета, а также эффективности предлагаемого метода коррекции у женщин с неэффективными циклами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в анамнезе при наличии эмбрионов хорошего качества.

Материалы и методы исследования

В различных центрах репродукции Украины и зарубежья нами были изучены некоторые количественные и функциональные показатели системного и местного иммунитета у 226 бесплодных пациенток, включенных в программу ВРТ: 101 женщина с первым циклом ВРТ и 125 – в анамнезе которых было от одного до пяти неэффективных циклов. Иммунограммы изучали за 2 мес до проведения цикла и в процессе иммунокоррекции. В зависимости от ведущего звена нарушения иммунологического гомеостаза мы использовали следующую схему иммунотропной терапии (схема).

• При угнетении фагоцитарной активности нейтрофилов применяли производные пиримидина (метилурацил, пентоксил; дериваты нуклеиновых кислот в течение 1-2 мес в среднетерапевтических дозах).
• При угнетении Т-клеточного звена иммунитета назначали синтетический высокомолекулярный иммуномодулятор – полиоксидоний (N-оксидированное производное полиэтиленпиперазина с большой молекулярной массой).
• При сочетании угнетения фагоцитоза и Т-клеточного иммунитета использовали синтетические пептидные иммуномодуляторы (тимоген, иммунофан и др.).
• При повышенном уровне CD16+CD56+ назначали синтетический низкомолекулярный иммуномодулятор – галавит (5-амино-1,2,3,4- тетрагидрофталазин-1,4-диона натриевую соль).
• При наличии аутоиммунного компонента (антител к хорионическому гонадотропину человека [ХГЧ], тиреоидной пероксидазе [АТ-ТПО], тиреоглобулину [АТ-ТГ]; антиспермальных, антинуклеарных антител; антифосфолипидного синдрома) проводили плазмаферез с дальнейшим внутривенным введением иммуноглобулина.
• При дисбалансе местного иммунитета (снижение эндометриального LIF, повышенная экспрессия СD16+СD56+, IL-18) применяли галавит, внутриматочную озонотерапию (при отсутствии гиперпластических процессов и сактосальпинксов в анамнезе), внутриматочное введение мононуклеаров, активированных ХГЧ [12].

При наличии аутоиммунных процессов, а также при повышении активности цитотоксических NK-клеток нами широко применялся препарат галавит – СНИ, который представляет собой 5-амино-1,2,3,4- тетрагидрофталазин-1,4-диона натриевую соль; разрешен к клиническому применению с 1997 г. За счет низкомолекулярной структуры он не обладает аллергенными свойствами, имеет дозозависимый эффект, характеризуется антиоксидантным и дезинтоксикационным действием. Клетками-мишенями для галавита являются макрофаги, нейтрофилы и Т-лимфоциты. Препарат регулирует активность макрофагов, цитотоксическую активность лимфоцитов и NK-клеток, синтез IFN-α, -γ, повышает синтез фибронектина, стимулирует бактерицидную активность нейтрофилов. Кроме того, оказывает действие на гуморальное звено иммунитета путем регуляции цитотоксической активности лимфоцитов, регуляции синтеза антител, повышения их аффинности (за счет активации Тh2), нормализует количество В-лимфоцитов. Воздействие на систему кровообращения заключается в снижении агрегации тромбоцитов и тромбообразования. Галавит нормализует баланс цитокинов Th1 и Th2 за счет ингибирования синтеза провоспалительных цитокинов Th1 (IL-1, IL-2, TNF-α), повышения синтеза противовоспалительных цитокинов Th2 (IL-3, IL-10), ингибирования синтеза простагландинов и повышения активности Th2 [13].
Важным является факт дозозависимого эффекта препарата. Для активации клеточного звена иммунитета галавит назначали в дозе 0,1 г ежедневно на протяжении 5-10 дней внутримышечно или ректально. При наличии аутоантител, повышенной активности цитокинов, продуцируемых Th1, цитотоксической активности лимфоцитов и NK-клеток –
0,2 г внутримышечно 3-5 дней в комбинации с иммуноглобулином и антигистаминными препаратами (данная комбинация способствует подавлению антителообразования) [14].

Результаты и их обсуждение

В ходе исследования у пациенток, включеных в программу ВРТ, выявлены отклонения в состоянии как клеточного, так и гуморального системного и местного иммунитета. По сравнению с группой фертильных женщин, у больных бесплодием достоверно чаще наблюдались лейкопения, относительный и абсолютный лимфоцитоз, достоверное уменьшение относительного и абсолютного количества Т-лимфоцитов. Иммунорегуляторный индекс был снижен у 80,85% женщин, в основном за счет снижения популяции СD4+.
Особого внимания заслуживает факт увеличения в 50% случаев относительного, а в 55,3% – абсолютного количества активированных NK-клеток. Изменения были более выраженными у лиц с неэффективными циклами ВРТ в анамнезе.
При сопоставлении показателей иммунограммы и особенностей клинической картины у женщин с лейкопенией у 64 (28%) из них достоверно чаще выявляли сактосальпинксы, рецидивирующий бактериальный вагиноз, хронический тонзиллит, аппендэктомию в анамнезе, гипотиреоз. Продолжительность бесплодия у них была достоверно выше (р < 0,05).
У больных с лимфоцитозом достоверно чаще наблюдались первичное бесплодие, персистенция вирусной инфекции. У 30% пациенток отмечено сочетание абсолютного уменьшения количества СD3+ клеток и увеличения NK-клеток; из них у 90% – в анамнезе имелись неэффективные циклы ВРТ, у 10% – беременность была биохимической или закончилась самопроизвольным абортом.
На фоне выраженного угнетения клеточного иммунитета наблюдалась активация гуморального звена: увеличение количества СD20+ выявлено у 50% женщин, повышение уровня иммуноглобулина класса М (IgM) – у 60%.
При исследовании показателей кислородзависимой бактерицидности и поглотительной активности нейтрофилов наблюдалось повышение показателей спонтанного теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-теста), а также индекса активации нейтрофилов. В то же время резервные возможности окислительно-восстановительного потенциала нейтрофилов (НСТ рез) и показатели фагоцитоза были достоверно сниженными.
Наличие различных аутоантител выявлено у 38% пациенток (у 32% – АТ-ТПО, АТ-ТГ). Отклонения в состоянии эндометриального иммунитета сопровождались нарушением цикличности секреции LIF во второй фазе МЦ, более выраженным у пациенток с неэффективными циклами ВРТ в анамнезе. По данным наших исследований, при концентрации эндометриального LIF ниже 6,8 пг/мл беременность не наступала, ниже 60 пг/мл – наступила в 5% случаев, при 60-90 пг/мл – в 33%, выше 90 пг/мл – частота беременностей была выше 70%. Вместе с тем наличие IL-18 в маточном смыве обнаружено у 90% пациенток с неэффективными циклами ВРТ в анамнезе. У таких женщин в анамнезе уровень экспрессии цитотоксических клеток в пролиферативную фазу был выше в 2,4 раза, а в фазу секреции – в 2,1 раза по сравнению с группой здоровых лиц (р < 0,05).
Применение предложенной схемы способствовало нормализации показателей (процент от выявленной патологии) СD3+ – у 76%, СD4+ – у 94% больных; абсолютного числа NK-клеток – у 69%, IL-18 – у 83% женщин. Средний уровень эндометриального LIF отмечали у 69,29% пациенток (44,6% исходный показатель). У 64,4% лиц с неэффективными циклами ВРТ в анамнезе при наличии эмбрионов хорошего качества наступила прогрессирующая клиническая беременность.

Выводы

Одной из причин неэффективных циклов IVF-ET при наличии эмбрионов хорошего качества является иммунологический дисбаланс. Выявлены отклонения как клеточного, так и гуморального системного и местного иммунитета: достоверное уменьшение количества СD3+, СD4+, СD8, иммунорегуляторного индекса за счет снижения популяции СD4+. Отмечаются увеличение абсолютного и относительного количества активированных NK-клеток, высокая активность системы макрофагов, гиперпродукция провоспалительных цитокинов и аутоантител. Нарушение эндометриальной иммунореактивности сопровождается нарушением цикличности секреции эндометрием LIF, экспрессии IL-18, дисбалансом NК-клеток. Применение предложенной схемы иммунокоррекции привело к наступлению прогрессирующей беременности у 64,4% пациенток с неэффективными циклами ВРТ при наличии эмбрионов хорошего качества в анамнезе.

Литература

1. Іванюта Л.І. Імунологічна регуляція репродуктивного процесу / Л.І. Іванюта, С.О. Іванюта // Здоровье женщины. – 2006. – Т. 2, № 26. – С. 140-145.
2. Сухих Г.Т. Иммунология беременности / Г.Т. Сухих, Л.В. Ванько. – М.: РАМН, 2003. – 400 с.
3. D. Metсalf // Int. J. Cell. Clon. – 1991. – Vol. 9,
   № 2. – P. 95-108.
4. Expression of interleukin (IL)-11 receptor by the human endometrium in vivo and effects of IL-11, IL-6 and LIF on the production of MMP and cytokines by human endometrial cells in vitro / B.A. Cork, E.M. Tuckerman,
   T.C. Li, S.M. Laird // Mol. Hum. Reprod. – 2002. –
   Vol. 8, № 9. – P. 841-848.
5. Амбарцумян Э.М. Роль фактора, ингибирующего лейкемию в репродкуции человека / Э.М. Амбарцумян, Л.М. Агаджанова // Акушерство и гинекология. –
   2004. – № 2. – C. 17-21.
6. Effect of leukemia inhibitory factor (LIF) on the quality of in vitro produced mouse blastocysts and subsequent derivation of embryonic stem (ES) cells. / R. Rungsiwiwut, S. Rungarunlert, P. Numchaisrika [et al.] // J Med Assoc Thai. – 2008. – № 91(5). – P. 608-14.
7. Investigation and treatment of repeated implantation failure following IVF-ET / [E.J. Margalioth1, A. Ben-Chetrit, M. Gal, T. Eldar-Geva] // The Author [published by Oxford University Press on behalf of the European Society of Human Reproduction and Embryology]. – 2006.
8. Disturbances in the LIF pathway in the endometrium among women with unexplained infertility / L. Aghajanova, S. Altm e, K. Bjuresten [et al.] // Fertil Steril. – 2008.
9. Coexpression of pinopodes and leukemia inhibitory factor, as well as its receptor, in human endometrium /
   L. Aghajanova, A. Stavreus-Evers, Y. Nikas [et al.] // Fertil. Steril. – 2003. – Vol. 79, № 1. – Р. 808-814.
10. F. Olivennes, N. Ledee-Bataille, M. Samana [et al.] // Fertil end Steril. – 2002. – Vol. 78, №3. – P. 13.
11. Гюльмамедова И.Д. Проблемы имплантации в программе IVF / И.Д. Гюльмамедова // Новости медицинской фармации. Гинекология. – 2008. –
    № 253. – С. 17-27.
12. Chennazhi K.P. Regulation of angiogenesis in the primate endometrium: vascular endothelial growth factor / K.Р. Chennazhi, N.R. Nayak // Semin. Reprod. Med. – 2009. – Vol. 27, № 1. – Р. 80-89.
13. Шульженко А.Е. Галавит в терапии хронической рецидивирующей герпесвирусной инфекции /
    А.Е. Шульженко, И.Н. Зуйкова // Новые лекарства. – 2003. – № 3. – С. 1-4.