Молекулярно-біологічні маркери ризику виникнення ранніх диспластичних змін епітелію шийки матки

У статті представлено результати комплексного обстеження жінок репродуктивного віку (n = 90), інфікованих вірусом папіломи людини. При обстеженні використано метод полімеразної ланцюгової реакції, кольпоскопічне дослідження, метод рідинної цитології та імуноцитохімічний метод визначення капсидного білка L1 у цервікальних мазках. Отримані результати дозволяють зі значним ступенем достовірності оцінити ризик прогресування визначених диспластичних змін епітелію шийки матки.

Ключові слова: вірус папіломи людини, рідинна цитологія, капсидний білок L1, диспластичні зміни епітелію шийки матки.

Проблема папіломавірусної інфекції (ПВІ) привертає все більшу увагу акушерів-гінекологів у зв’язку з високою поширеністю, труднощами в діагностиці та лікуванні. Так, згідно з даними Центрів з контролю і профілактики захворювань США, до 50-річного віку вірусом папіломи людини (ВПЛ) інфікуються як мінімум 80 % жінок [1, 2]. Досить тривожним є той факт, що найбільш часто ПВІ відзначається в осіб віком до 25 років, тобто серед молодих жінок репродуктивного віку [3, 4].

Тривала інфекція, викликана ВПЛ, передається статевим шляхом епітеліотропним ДНК-вірусом; майже у всіх випадках є пусковим механізмом дисплазії епітелію шийки матки та основною причиною розвитку раку шийки матки (РШМ). ВПЛ високого онкогенного ризику регулярно виявляється при тяжких цервікальних інтраепітеліальних неоплазіях (CIN) і інвазивному РШМ. Численні дослідження показують, що ПВІ здебільшого (до 90-95 %) перестає визначатися молекулярними методами діагностики протягом двох років від початку спостереження, що підтверджує мимовільну елімінацію вірусу. У таких випадках для досліджень переважно відбирали ВПЛ-позитивних жінок, які протягом 12-72 міс (із середнім інтервалом у 6 міс) проходили тест на ВПЛ методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Тривалість інфекції залежить від типу ВПЛ (високого або низького онкогенного ризику), віку (більша у жінок старших за 30 років, ніж у жінок до 24 років), наявності пологів у минулому, куріння і прийому оральних контрацептивів [2, 5, 6].

У процесі мимовільної елімінації вірусу з організму провідна роль належить імунному механізму. Серед білків, що входять до складу вірусної частки, капсидний білок L1 є основним імуногеном, який стимулює розвиток противірусного імунітету. Капсидний білок L1 – один з восьми відомих білків, специфічних для ВПЛ (E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, L1 і L2). Під час продуктивної фази життєвого циклу вірусу в цитоплазмі клітин епітелію продукується білок L1, після чого він переміщається в ядро клітини, де може бути виявлений імуноцитохімічним методом у проміжних і поверхневих клітинах плоского епітелію [6].

Програми обстеження шийки матки з метою виявлення преінвазивних новоутворень є високоефективними. Їх впровадження призвело до зменшення кількості випадків інвазивного РШМ. У результаті цього передпухлинні стани шийки матки діагностуються часто, а вартість лікування слабко виражених внутрішньоепітеліальних уражень останніми роками істотно зросла [1, 3].

Для визначення тактики ведення інфікованих жінок було б дуже корисно мати прогностичні маркери, що розділяють пацієнток на тих, у кого ранні ушкодження розвинуться в ракову пухлину, і на тих, у кого цього не станеться.

G. Henrik Griesser et al. (Іститут патології і клінічної цитології, Німеччина) почали досліджувати ВПЛ у стандартно пофарбованих цитологічних мазках імуноцитохімічними методами, використовуючи антитіла до капсидного білка L1. Особливою методичною перевагою виявлення капсидного білка L1 є те, що він синтезується в диференційованому плоскому епітелії поверхневого шару, який добре ідентифікується при дослідженні мазка [7].

Наявність білка L1 у диспластичних клітинах (позитивний результат аналізу) є підтвердженням завершеного життєвого циклу ВПЛ. У свою чергу негативні результати аналізів на наявність білка L1 свідчать про те, що він втратив можливість виробляти віріони залежно від диференціювання клітин плоского епітелію [7]. Цілком ймовірно, що наявність швидкої (протягом 6 міс) прогресії легких і помірних дисплазій до ураження CIN ІІІ підтверджує думку про те, що розвиток захворювання може бути пов’язаний з локальними порушеннями імунної системи. Білок L1, будучи ознакою непродуктивної ПВІ, може з часом призвести до порушення вірусно-клітинної взаємодії, що в свою чергу спричиняє зміни регулювання клітинного циклу на транскрипційному, трансляційному і геномному рівнях [7, 8].

Загалом результати досліджень німецьких учених є додатковим підтвердженням того, що імуноцитохімічне виявлення капсидного білка L1 є високоефективним маркером прогнозування плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень низького (LSIL) і високого ступеня (HSIL).

Таким чином, просте, контрольоване цитоморфологічне дослідження, яке можна проводити на стандартних і тонкошарових препаратах, має велике прогностичне значення при CIN І-ІІ. Наявність експресії білка L1 при виявленні атипових клітин плоского епітелію невизначеного значення (ASC-US) і LSIL дозволяє прогнозувати ймовірність (від 70 до 85 % за різними джерелами) регресії змін сквамозного епітелію та мимовільну елімінацію вірусу. Це виправдовує вичікувальну стратегію ведення пацієнток з метою уникнення медикаментозного навантаження, особливо у молодих жінок. Ранні диспластичні зміни з негативною експресією білка L1 є свідченням значного ризику прогресування процесу з вірогідністю виникнення злоякісної пухлини. У цих випадках рекомендується ретельний цитологічний моніторинг поряд з кольпоскопією і гістологічним дослідженням [7-9].

Матеріали та методи дослідження

У дослідження включено 90 пацієнток з доброякісною патологією шийки матки та інфікуванням ВПЛ. Усі жінки були репродуктивного віку, середній вік становив 28,34 ± 0,09 року.

Виконували ПЛР згідно з рекомендаціями виробника діагностичних наборів – компанії «Лаборатория ИЗОГЕН» (Москва, Росія). Напівкількісну оцінку ДНК ВПЛ проводили шляхом ампліфікації десятикратних розведень зразка до кінцевої точки при відомій чутливості методу (< 100 копій). Рівні ДНК ВПЛ < 100 копій/10⁵ лейкоцитів вважали низькими, від 100 до 1000 копій – середніми, > 1000 копій/10⁵ лейкоцитів – високими.

Кольпоскопічне дослідження проводили за стандартною методикою. Для інтерпретації кольпо­скопічної картини використовували міжнародну класифікацію кольпоскопічних термінів, запропоновану Номенклатурним комітетом Міжнародної федерації по кольпоскопії і цервікальній патології (IFCPC), схваленій на 14-му Всесвітньому конгресі IFCPC (Бразилія, 2011) [9]. Під час розширеної кольпоскопії оцінювали колір шийки матки, стан поверхні, характер епітеліального покриву і зони стику багатошарового плоского і циліндричного епітеліїв, стан судинного рисунку. З метою детальної характеристики результатів кольпоскопічного дослідження нами застосовано кольпоскопічний індекс, модифікований Reid (The modified Reid colposcopic index, RCI). Враховували наступні кольпоскопічні ознаки: характер поверхневого контура шийки матки, товщину епітеліального покриву, результати оцтової та йодної проб, а також наявність змін судинного рисунку. Значення RCI 0-2 бали свідчить про ймовірність CIN I; 3-4 бали – про ймовірність CIN ІI; 5-8 балів – про ймовірність CIN IІІ. Для якісної характеристики кольпоскопічних картин використовували систему Coppleson (M. Coppleson Grading System, 1993).

Для виконання капсидного тесту було використано цервікальні мазки вологої фіксації, відібрані за допомогою гінекологічних щіточок та шпателя Ейра. Капсидний тест проводили із застосуванням полімерної методики EnVision FLEX (Dako Denmark A/S). Пригнічення ендогенної пероксидази здійснювали пероксидазним блоком протягом 20 хв. Використовували специфічні імуноглобуліни до ВПЛ клон MabК1Н8. Інкубували 30 хв при кімнатній температурі. Для підсилення реакції застосовували мишачий зв’язок (Mouse Linker) та полімер, кон’югований з ферментом. Діамінобензидином проявляли реакцію, наявність якої фіксували за допомогою світлооптичного мікроскопа EZ-122 (ERMA). Специфічною позитивною реакцією, що свідчила про активність продуктивної фази інфекції, вважалась ядерна.

Результати дослідження та їх обговорення

Усім пацієнткам проводили визначення рівня вірусного навантаження за допомогою методу ПЛР. При цьому незначний рівень вірусного навантаження (1000-100 вірусних частин у пробі) відмічено у 36 (40,0 %) обстежених, помірний (3000-1000 вірусних частин у пробі) – у 30 (33,3 %), високий (5000-3000 вірусних частин у пробі) – у 24 (26,7 %) жінок.

При дослідженні мазків з цервікального каналу методом рідинної цитології у 23 (25,5 %) осіб встановлено досить виразну запальну інфільтрацію, яка мала вогнищевий характер та була представлена здебільшого нейтрофілами, лімфоцитами та макрофагами. При цьому виявлялись характерні для вірусного інфікування цитологічні ознаки, зумовлені цитопатогенною дією ДНК-вмісних ВПЛ: койлоцити, двоядерні клітини та багатоядерні симпласти, кератиноцити. Цитологічні зміни, що характерні для CIN I відмічено у 45 (50,0 %) пацієнток, інфікованих ВПЛ, а для CIN ІI – у 22 (24,4 %) обстежених.

Для визначення експресії капсидного білка L1 в диспластично змінених клітинах сквамозного епітелію у пацієнток з ПВІ було застосоване імуноцитохімічне фарбування з антитілом до білка L1 (Dako Denmark A/S). На рисунку 1 представлена негативна реакція на капсидний білок за відсутності інфікування ВПЛ.

Рис. 1. Капсидний тест. Негативна реакція на капсидний білок у диспластично змінених клітинах сквамозного епітелію Цервікальний мазок. Імуноцитохімічне фарбування з антитілом до білка L1 (Dako Denmark A/S). Збільшення х 20.

Рис. 1. Капсидний тест. Негативна реакція на капсидний білок у диспластично змінених клітинах сквамозного епітелію Цервікальний мазок. Імуноцитохімічне фарбування з антитілом до білка L1 (Dako Denmark A/S). Збільшення х 20.

Позитивна реакція на капсидний білок у ядрах клітин сквамозного епітелію є свідченням продуктивної фази вірусу, для якої характерним є розмноження вірусних капсидів, руйнування епітеліоцитів та презентація вірусного антигену в імунній системі жінки, тобто є вірогідність мимовільної елімінації ВПЛ та регресії легких диспластичних змін епітелію шийки матки (рис. 2).

Рис. 2. Капсидний тест. Позитивна реакція на капсидний білок у ядрах клітин сквамозного епітелію при інфікуванні ВПЛ. Цервікальний мазок. Імуноцитохімічне фарбування з антитілом до білка L1 (Dako Denmark A/S). Збільшення х 20.

Рис. 2. Капсидний тест. Позитивна реакція на капсидний білок у ядрах клітин сквамозного епітелію при інфікуванні ВПЛ. Цервікальний мазок. Імуноцитохімічне фарбування з антитілом до білка L1 (Dako Denmark A/S). Збільшення х 20.

На рисунку 3 представлено виражену цитоплазматичну експресію капсидного білка L1 в епітеліо­циті, що демонструє наявність ПВІ. Відсутність ядерної реакції є негативною прогностичною ознакою, оскільки свідчить про уникнення вірусом контролю імунної системи жінки, при цьому не стимулюється розвиток специфічного імунітету.

Рис. 3. Капсидний тест. Виражена цитоплазматична експресія капсидного білка ВПЛ в епітеліоциті за відсутності ядерної реакції. Цервікальний мазок. Імуноцитохімічне фарбування з антитілом до білка L1 (Dako Denmark A/S). Збільшення х 40

Рис. 3. Капсидний тест. Виражена цитоплазматична експресія капсидного білка ВПЛ в епітеліоциті за відсутності ядерної реакції. Цервікальний мазок. Імуноцитохімічне фарбування з антитілом до білка L1 (Dako Denmark A/S). Збільшення х 40

Під час розширеного кольпоскопічного дослідження в обстежених жінок були визначені зміни, що характерні для доброякісних (фонових) процесів та диспластичних уражень епітелію шийки матки, а саме: ектопія та екторопіон, нормальна та атипова зона трансформації, оцтово-білий епітелій, пунктація, мозаїка, зроговілі залози, лейкоплакія, йоднегативна ділянка, ендометріоз шийки матки, рубцева деформація шийки матки, кондилома та запалення.

Ектопія циліндричного епітелію визначалась як ділянка яскраво-рожевого кольору із сосочковою поверхнею. Цю ознаку відмічено у 40 (44,4 %) жінок.

Нормальна зона трансформації (плоскоклітинна метаплазія, відкриті, закриті залози) спостерігалась у 14 (15,6 %) обстежених. Посттравматичні зміни шийки матки (деформації зовнішнього вічка, старих розривів та рубців, нерівної межі між багатошаровим плоским та циліндричним епітеліями), що сприяють розвитку та персистенції патології шийки матки, відмічено у 15 (16,7 %) жінок. Ендометріоз шийки матки, діагностований нами у 12 (13,3 %) осіб, при розширеній кольпоскопії та візуальному огляді мав вигляд кровоточивих ділянок розмірами 0,1-0,5 см та субепітеліальних кіст синюшного кольору. На нашу думку, така частота даної патології зумовлена наявністю рубцевої деформації шийки матки та її лікуванням в анамнезі обстежених жінок.

Досить часто були відмічені такі ознаки, як оцтово-білий епітелій та мозаїка (у вигляді полігональних фігур з межами рожевого кольору на фоні оцтово-білого епітелію): відповідно у 51 (56,7 %) та 43 (47,8 %) пацієнток. Пунктація визначалась у 22 (24,4 %) випадках у вигляді численних червоних крапок на ділянках епітелію (судинні петлі).

Спостерігали лейкоплакію у 18 (20,0 %) жінок з інфікуванням ВПЛ. Йоднегативні ділянки (ділянки патологічного епітелію, що визначаються як йоднегативні зони з чіткими контурами при проведенні проби з розчином Люголя) відмічено у 39 (43,3 %) обстежених.

На особливу увагу заслуговували випадки кондиломатозного цервіциту та вагініту, що спостерігалися у 12 (13,3 %) пацієнток з ПВІ. Кольпоскопічна картина дифузного обсіменіння плоского епітелію статевих органів при цьому мала вигляд дрібних шилоподібних виростів, які після проби з розчином оцтової кислоти набували білого кольору, а при пробі Шиллера – йоднегативних крапок на фоні незміненого епітелію темно-­коричневого кольору.

Слід відмітити, що ПВІ шийки матки у 57 (63,3 %) хворих поєднувалась з ознаками хронічного екзоцервіциту. Цей факт свідчить про труднощі диференціювання змін епітелію, зумовлених та не зумовлених дією ВПЛ.

Важливою ознакою атипової зони трансформації є зроговілі залози та атипові судини – ­судини зі зміненою структурою у вигляді штопора, шпильки, коми, які не реагують на обробку розчином оцтової кислоти. Ці ознаки зустрічались відповідно у 25 (27,8 %) та 21 (23,3 %) випадках та свідчать про інтраепітеліальні ураження високого ступеня тяжкості.

У шести (6,7 %) жінок з ПВІ результати кольпоскопії були незадовільними, що зумовлено відсутністю візуалізації зони стику багатошарового плоского та циліндричного епітеліїв внаслідок вікових змін або попередніх інвазивних методів лікування патології шийки матки.

З метою детальної характеристики результатів кольпоскопічного дослідження застосовували кількісний аналіз за Reid. При цьому у 34 (37,8 %) пацієнток RCI становив 0-2 бали, що вказує на ймовірність CIN I. Найчастіше, а саме у 46 (51,1 %) обстежених, було визначено оцінку 3 бали, що свідчило про ймовірність CIN IІ. Оцінка ≥ 4 балів відмічалась досить рідко: у 10 (11,1 %) пацієнток, оскільки відповідні їй кольпоскопічні ознаки спостерігаються переважно при CIN IІ-ІІІ.

Під час якісного аналізу кольпоскопічних картин із застосуванням системи Coppleson у пацієнток з інфікуванням ВПЛ у 41 (45,6 %) особи було помічено визначальні кольпоскопічні ознаки, зокрема щільний оцтово-білий та непрозорий епітелій, нерівномірність та збільшення розмірів судин, груба пунктація та мозаїка, а у 49 (54,4 %) обстежених – невизначальні (прозорий та напівпрозорий оцтово-білий епітелій із нечіткими ме­жами, з короткими міжкапілярними проміжками, відсутністю атипових судин).

Аналіз даних розширеної кольпоскопії продемонстрував, що за наявності патологічних змін шийки матки, у жінок з інфікуванням ВПЛ переважала аномальна кольпоскопічна картина. У зв’язку з великою різноманітністю проявів ПВІ складно визначити специфічний комплекс кольпоскопічних ознак. При різних ступенях ураження картина буває різною. Слід рекомендувати широке використання проби Шиллера, за допомогою якої виявляється багато прихованих форм ПВІ шийки матки, котрі неможливо побачити неозброєним оком та під час простої кольпоскопії.

Висновки

Таким чином, результати наших досліджень свідчать про високу інформативність кольпоскопічного дослідження в діагностиці захворювань шийки матки (доброякісних фонових процесів та диспластичних змін епітелію), що має важливе значення для вибору адекватного методу лікування даної патології, особливо у молодих жінок. Проте відсутність уражень екзоцервікса під час візуального огляду та кольпоскопії не виключає відсутність змін при цитологічному і морфологічному дослідженнях.

Наявність експресії білка L1 при диспластичних ураженнях епітелію шийки матки дозволяє прогнозувати вірогідність їх регресії та елімінації ВПЛ з організму. Диспластичні зміни з негативною експресією білка L1 несуть в собі ризик прогресування процесу з вірогідністю злоякісної трансформації епітеліальних клітин шийки матки.

Отже, тест на вірусний білок L1 сьогодні є єдиним лабораторним тестом, що дає можливість оцінити ризик прогресування змін сквамозного епітелію і розвитку РШМ.

Список використаної літератури

1. Киселев В. И. Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки / В. И. Киселев – М.: Компания «Димитрейд График Групп». – 2004. – 184 с.

2. Мазуренко М. М. Роль вирусов папилломы в канцерогенезе шейки матки / М. М. Мазуренко // Современная онкология. – 2003. – № 1. – С. 7-10.

3. Куевда Д. А. Современная концепция диагностики папилломавирусной инфекции: материалы Межрегиональной науч.- практ. конф. «Дерматовенерология в период реформирования здравоохранения и реализации национальных проектов», 22-23 мая 2007. – Екатеринбург. – С. 112-113.

4. Перламутров Ю. Н. Современные подходы в терапии пациентов с папилломавирусной инфекцией гениталий / Ю. Н. Перламутров, Н. И. Чернова // Эффективная фармакотерапия в акушерстве и гинекологии. – 2007. – № 2. – С. 15-19.

5. Scott M. Cell-mediated immune response to hu­man papillomavirus infection / M. Scott, M. Nakagawa, A-B. Moscicki // Clin. Diagn. Lab. Im­munol. – 2001. – № 8. – P. 209-220.

6. Yang R. Papillomavirus capsid mutation to escape dendritic cell-dependent innate immunity in cervical cancer / R. Yang, CM. Wheeler, X. Chen [et al.] // J. Virology. – 2005. – № 79. – P. 6741-6750.

7. Griesser H. Correlation of immunochemical detection of HPV L1 capsid protein in Рap smears with regression of high-risk HPV positive mild / moderate dysplasia / H. Griesser, H. Sander, R. Hilfrich [et al.] // Anal Quant Cytol Histol. – 2004. – № 26. – P. 241-245.

8. Griesser H. Immunchemische Untersuchungen mit Antikrpern gegen das humane Papillomvirus (HPV) an Routineabstrichen der Zervix uteri / H. Griesser, S. Zeck, W. Kayser-Schmidt // Verh. Dtsch. Ges Zyt. – 2001. – № 22. – P. 97-98.

9. Turan T. Methylation of the human papillomavirus-18 L1 gene: A biomarker of neoplastic progression? / T. Turan, M. Kalantari, IE Calleja-Macias [et al.] // Virology. – 2006. – № 349. – P. 175-183.

Молекулярно-биологические маркеры риска развития ранних диспластических изменений эпителия шейки матки

В. К. Кондратюк, Н. Д. Коблош, Н. Е. Горбань

Представлены результаты комплексного обследования 90 женщин репродуктивного возраста, инфицированных вирусом папилломы человека. При обследовании использовано диа­гностику путем полимеразной цепной реакции, кольпоскопическое исследование, метод жидкостной цитологии и иммуноцитохимиче­ский метод определения капсидного белка L1 в цервикальных мазках. Полученные результаты позволяют со значительной степенью достоверности оценить риск прогрессирования диспластических изменений эпителия шейки матки.

Ключевые слова: вирус папилломы человека, жидкостная цитология, капсидный белок L1, диспластические изменения эпителия шейки матки.

Molecular and biological risk markers of development of early dysplastic changes in cervical epithelium

V. Kondratyuk, N. Koblosh, N. Gorban

The results of a complex examination of 90 women of reproductive age infected with the human papilloma virus is presented. In the study diagnostic by the polymerase chain reaction, colposcopy, method of liquid-based cytology and an immunocytochemical method for determining the L1 capsid protein in cervical smears were conducted. The obtained results with a considerable degree of accuracy allow to estimate the risk of progression of dysplastic changes in cervical epithelium.

Keywords: human papillomavirus, liquid-based cytology, capsid protein L1, dysplastic changes in cervical epithelium.